椒蒿精油对几种植物病原菌的抑制作用研究

任艳利 牛之函 刘琳玉 刘远芳

摘 要：目的：研究椒蒿精油对植物病原真菌的抑制作用，探索其在抑菌方面的功能，为天然抗菌剂的开发提供理論依据。方法：以椒蒿精油为原料，采用菌丝生长速率法，测定其对5种植物病原真菌的抑菌作用。结果：浓度为5.0μL/mL的椒蒿精油处理5d，对灰葡萄孢菌有100%的抑制作用。最低抑菌浓度（MIC）测定显示，椒蒿精油对5种供试菌的抑制作用从强到弱依次为灰葡萄孢菌>油菜菌核病菌>辣椒疫霉病菌>棉花枯萎病菌>菜豆炭疽病菌。结论：椒蒿精油对植物病原真菌具有良好的抑制作用，在农药领域中，用椒蒿精油防治植物病原真菌具有很好的应用潜力。

关键词：椒蒿精油;植物病原真菌;菌丝生长;抑菌作用

中图分类号 R284文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）16-0085-05

Abstract：To study the inhibitory effect of Artemisia essential oil on plant pathogenic fungi and explore its antibacterial function，so as to provide a theoretical basis for the development of natural antimicrobial agents. The antibacterial activity of Artemisia essential oil was study by the method of mycelial growth rate，which was used to 5 plant pathogenic fungi. The treatment of 5d with Artemisia essential oil，a volume fraction of 5.0μL/mL showed a 100% inhibitory effect on Botrytis cinerea. The determination of minimum inhibitory concentration （MIC） showed that the inhibition effect of Artemisia essential oil on 5 kinds of tested bacteria from strong to weak were，Brassica sclerotiorum、Sclerotinia sclerotiorum、 Phytophthora capsici，Fusariurn oxysporum f、Colletotrichum linde-muthianum. The results showed that the essential oil of Artemisia had a good inhibitory effect on plant pathogenic fungi，and it had good application potential in controlling plant pathogenic fungi with Artemisia essential oil in the field of pesticide.

Key words：Essential oils;Plant pathogenic fungi;Mycelial growth;Antibacterial function

植物精油（Essential oils，Eos），又称挥发油（volatile oils），属于植物次生代谢产物[1]中的萜类化合物，多是单萜和倍半萜。其广泛分布于植物界，存在于腺细胞和表皮中，具有强烈的气味和香味，可防止害虫侵袭[2]。在农业生产过程中，由植物病原真菌引起的病害约占植物病害总数的70%～80%。精油对真菌等微生物有着强烈的抑制作用或是对其有很强的杀伤力。众多研究表明，生姜精油、红葱头精油、蓼子朴花精油、百里香精油、薰衣草精油、柠檬精油、罗勒精油对植物病原菌均有不同程度的抑制作用[3-11]。除了对植物病原菌有抑制作用外，植物精油对一些真菌和毒素也有抑制作用[12-15]，除此之外，植物精油在临床上已被用于治疗一些疾病[16，17]，在保鲜技术方面也发挥着一定的功效[18-21]。

新疆维吾尔自治区拥有丰富的药用植物资源，尤其是位于中亚地区的伊犁河谷一带地处内陆高寒地带，气候湿润、雨量充沛，独特的自然条件孕育了超过1000种的药用植物资源，是药用植物在新疆分布最多的区域。椒蒿（Artemisia dracunculus L.），为菊科龙蒿植物，半灌木状草本。在新疆博尔塔拉蒙古自治州的精河县、温泉县，哈密地区巴里坤哈萨克自治县，伊犁哈萨克自治州察布查尔锡伯自治县等地，都有野生椒蒿资料分布。椒蒿含挥发油，尤其是幼嫩的顶芽中含有丰富的挥发油。

随着人类健康和环保意识的不断增强，低毒、高效的抑菌剂已成为了国内外学者研发的热点。研究表明：芳香植物精油有一定的杀菌、杀虫能力，被认为是极具开发潜力的新一代植物源农药。在农药残留危害日渐加剧、植物病原菌对化学杀菌剂产生抗药性的严峻形势下，精油可作为一种亟待开发的新型杀菌物质进行研究[8-12]。为此，本研究开展了椒蒿精油对几种主要植物病原真菌的抑菌效果试验，采用菌丝生长速率法，测定不同精油浓度对菌丝生长的相对抑制率，并测定精油最低抑菌浓度（MIC），为植物精油类新型杀菌物质的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 椒蒿精油：2018年5月份于察布查尔县孙扎齐乡雀儿盘村采样，由伊犁师范大学杨哓绒副教授鉴定为椒蒿。椒蒿顶芽部分自然风干后，粉碎后以水作为溶剂，用挥发油提取器采用水蒸气蒸馏法提取8h获得。供试菌种：棉花枯萎病菌[（Fusariurn oxysporum f. sp. Vasinfectum （Atk.） Snyder &Hansen）]、灰葡萄孢菌（Botrytis Cinerea）、油菜菌核病菌[（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）]、辣椒疫霉病菌（Phytopthora capsici）、菜豆炭疽病菌（Colletotrichum linde-muthianum），均由伊犁师范大学焦子伟老师提供。供试病菌由PDA固体培养基培养并备用。

1.2 方法

1.2.1 PDA培养基配制 称取去皮土豆200g，切成小块放入锅中，加水1000mL，加热至沸腾，维持20～30min，用6层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000mL，加入葡萄糖20g、琼脂粉20g，小火加热至琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。121℃灭菌20min。

1.2.2 含精油培养基的配制 用琼脂稀释法结合菌丝生长速率法对椒蒿精油的抑菌活性进行测定。准确吸取不同体积的椒蒿精油与0.1%吐温-80充分混合，乳化好的精油混合液加入已冷却至50℃左右的PDA固体培养基中，在无菌环境中倒人培养皿中，得到椒蒿精油终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5.0μL/mL的培养基。同时，制备不含精油的PDA培养平板作为对照。

1.2.3 接种培养 用直径7mm的无菌打孔器取在PDA平板上培养4～7d的供试病原菌，并将其移植到上述含不同浓度的精油平板和空白对照（不含精油）的中央，每皿1块。将培养皿倒置于28℃的恒温培养箱内培养5d，从第1天开始，每天用十字交叉法测量供试菌菌落的直径，对结果进行统计分析，计算抑制率。计算公式如下：

生长速率（mm/d）=（菌落直径-7mm）/培养天数;

抑制率（%）=（对照生长速率-处理生长速率）/

对照生长速率×100

通过抑制率的大小，可判定椒蒿精油各菌落的抑菌活性等级。较强抑制：相对抑制率≥70%以上;中等强度抑制：相对抑制率40%～70%;较弱抑制：≤40%[13]。

1.2.4 最低抑制浓度（MIC）测定 根据上一步试验结果，采用琼脂稀释法测定椒蒿精油对不同病原菌的最低抑菌浓度（MIC）。将乳化好的不同体积精油溶液倒入已融化好的培养基中混合均匀。在无菌条件下倒入培养皿中，使平皿中精油的最终浓度分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0μL/mL。对照组中加入等体积吐温-80。取直径7mm的病原菌菌饼，将其接种到上述不同处理的培养皿中央，每个处理3次重复，在28℃条件下培养48h，对接种的菌种生长情况进行观察。测量菌落直径，计算抑制率。与对照组相比，以菌落完全没有生长的最低精油浓度为其MIC，有肉眼可见菌落生长者为无抑菌作用。

2 結果与分析

2.1 椒蒿精油对棉花枯萎病原菌菌丝生长的抑制作用 如图1所示：与空白对照相比，经椒蒿精油处理的棉花枯萎病菌菌丝的生长速率减小，随着精油浓度的逐步加大，菌丝的生长速率越来越小。随着处理时间的增加，抑制效果逐渐减弱。精油浓度为5.0μL/mL时，棉花枯萎菌在前3d未见生长，第4～5天菌丝的生长速率分别为1.2、2.0mm/d，菌丝生长的抑制率分别为88%、78.82%，这个浓度的精油表现出较强的抑制作用。精油浓度为2.5μL/mL时，棉花枯萎菌在前2d未见生长，第3～5天菌丝的生长速率分别为1.9、2.1、3.28mm/d，菌丝生长的抑制率分别为83.18%、79%、68.21%，这个浓度的精油表现出了较强的抑制作用。精油浓度为1.25μL/mL时，第2～5天菌丝的生长速率分别为2.85、3.07、3.73、4.54mm/d，菌丝生长的抑制率分别为75%、72.83%、62.7%、51.7%，这个浓度的精油表现出了中等抑制作用。精油浓度为0.625μL/mL时，棉花枯萎菌在第2～5天的菌丝生长速率分别为4、5.1、5.5、6.1mm/d，与对照相比有明显差异，菌丝生长的抑制率分别为64.91%、54.87%、45%、35.11%。与对照差异一般，表现出了较弱的抑制作用。

2.2 椒蒿精油对灰葡萄孢菌的抑制作用 如图2所示，精油浓度为5.0μL/mL、2.5μL/mL、1.25μL/mL、0.625μL/mL时，处理样5d内未见灰葡萄胞菌生长，生长速率为0，这几个浓度的精油表现出了较强的抑制作用，抑制率达100%。

2.3 椒蒿精油对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用 如图3所示，精油浓度为5.0μL/mL时，油菜菌核病菌在前3d未见生长，第4～5天菌丝的生长速率分别为0.55、0.72mm/d，菌丝生长的抑制率分别为86.9%、83.63%，这个浓度的精油表现出较强的抑制作用。精油浓度为2.5μL/mL时，油菜菌核病菌在第1～2天未见生长，第3～5天菌丝的生长速率分别为0.5、1.12、1.2mm/d，菌丝生长的抑制率分别为76.84%、73.3%、70.7%，这个浓度的精油抑菌活性较明显。精油浓度为1.25μL/mL时，第2～5天菌丝的生长速率分别为0.85、1.4、1.63、1.74mm/d，菌丝生长的抑制率分别为73.84%、65.15%、61.19%、58.18%，这个浓度的精油表现出中等的抑制作用。精油浓度为0.625μL/mL时，油菜菌核病菌在第2～5天菌丝的生长速率分别为1.35、1.9、2.45、2.52mm/d，与对照有明显差异，菌丝生长的抑制率分别为58.46%、50%、41.67%、36.21%，与对照差异一般，表现出了较弱的抑制作用。

2.4 椒蒿精油对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用 如图4所示，精油浓度为5.0μL/mL时，辣椒疫霉病菌在前4d未见生长，第5天菌丝的生长速率为0.6mm/d，菌丝生长的抑制率为87.44%，这个浓度的精油表现出了较强的抑制作用。精油浓度为2.5μL/mL时，辣椒疫霉病菌在第1～2天未见生长，第3～5天菌丝的生长速率分别为0.83、1.13、1.38mm/d，菌丝生长的抑制率分别为80%、74.49%、70.87%，这个浓度的精油表现出较强的抑制作用。精油浓度为1.25μL/mL时，第2～5天菌丝生长的速率分别为1.45、1.8、1.95、2.12mm/d，菌丝生长的抑制率分别为62.33%、56.83%、55.98%、53.71%，这个浓度的精油抑菌差异不明显。精油浓度为0.625μL/mL时，辣椒疫霉病菌在第2～5天菌丝的生长速率分别为1.4、2.2、2.48、2.76mm/d，与对照有明显差异，菌丝生长的抑制率分别为63.63%、47.24%、44.02%、39.74%，与对照差异一般，表现出了较弱的抑制作用。

2.5 椒蒿精油对菜豆炭疽病菌菌丝生长的抑制作用 如图5所示，在整个试验过程中，菜豆炭疽病菌的生长速率较快，第5天菌落直径接近6cm。当精油浓度为5.0μL/mL时，菜豆炭疽病菌在前3d未见生长，第4～5天菌丝的生长速率分别为0.63、1.34mm/d，菌丝生长的抑制率分别为87.75%、80.31%，这个体积分数的精油表现出了较强的抑制作用。精油浓度为2.5μL/mL时，菜豆炭疽病菌在第1～3天未见生长，第4～5天菌丝的生长速率分别为3.18、3.94mm/d，菌丝生长的抑制率分别为68.45%、62.69%，这个浓度的精油表现中等抑制作用。精油浓度为1.25μL/mL时，第3～5天菌丝的生长速率分别为3.8、6.95、7.36mm/d，菌丝生长的抑制率分别为59.87%、31.05%、30.3%，这个浓度的精油抑菌活性差异不明显。精油浓度为0.625μL/mL时，菜豆炭疽病菌在第2～5天菌丝的生长速率分别为2.6、6.6、7.75、8.7mm/d，与对照有明显差异，菌丝生长的抑制率分别为63.63%、30.31%、23.12%、17.61%。与对照差异一般，表现出了较弱的抑制作用。

2.6 最低抑菌浓度（MIC） 采用琼脂稀释法，将不同量的椒蒿精油加入融化并冷至50℃左右的定量PDA琼脂中，制成含最终精油浓度为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0μL/mL的平板，接种以上5种植物病原菌，孵育后观察受试菌生长情况，每一个浓度做3组平行试验，最终确定其MIC。如表1所示，椒蒿精油对灰葡萄胞菌菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度（MIC）最低为3.0μL/mL，对菜豆炭疽病菌的抑制效果最弱，最低抑菌濃度最高为6.0μL/mL。可见，椒蒿精油对5种植物病原菌的最低抑菌浓度为灰葡萄孢菌>油菜菌核病菌>辣椒疫霉病菌>棉花枯萎病菌>菜豆炭疽病菌。

3 结论

本次试验结果表明，椒蒿精油对5种植物病原菌的生长均具有一定的抑制作用，且抑菌效果随精油浓度的增加而增加。当椒蒿精油浓度在5.0μL/mL下处理5d，可完全抑制灰葡萄孢菌的生长，其抑制率达到100%;当椒蒿精油浓度在2.5μL/mL下处理5d，对油菜菌核病菌有较强的抑制作用;当椒蒿精油浓度在1.25μL/mL下处理5d，对油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌有中等的抑制作用;当椒蒿精油浓度在0.625μL/mL下处理5d，对菜豆炭疽病菌有较弱的抑制作用。

4 讨论

植物精油和化学抑菌剂相比，具有残留毒性和副作用小的特点，同时其显著的抑菌活性和广泛的抑菌范围，抑菌研究方面受到了广泛的关注，被认为是开发天然防腐保鲜剂和化妆品防腐剂的重要原料[20]。随着植物精油及其主成分对植物病原菌抑菌机制研究的日渐深入，使得农药研究领域日益关注利用精油对植物病原菌进行防治。利用天然抗菌剂对植物病原菌进行防治越来越受到了广泛的关注，刘凡等[8]研究发现，熏衣草精油几种植物病原真菌有明显的抑制作用;吴克刚等[17]研究发现，香辛植物精油对常见呼吸道致病菌有明显的抑制作用;王芳等[22]研究发现，肉桂精油对成团泛菌和腐生葡萄球菌有一定的抑制作用。

本研究仅开展了椒蒿精油对5种植物病原真菌的抑菌活性研究，对其他植物病原真菌是否也有抑菌活性还有待进一步验证;本研究仅进行了体外的抗菌活性检测，后期要继续进行体内的抑菌活性检测。此外，在椒蒿生长的不同时期（返青期、生长期、花蕾期、结实期），不同部位（顶芽、茎、根）精油的化学成分和含量都有很大的区别[23]。下一步要对不同时期、不同部位的精油的主要成分进行抑菌试验，以便进一步确定椒蒿精油中的主要抑菌成分。另外，当前学者们对椒蒿精油的研究主要集中在抗氧化作用，对椒蒿精油抗真菌作用机理的研究尚处于起步阶段，对将其开发成新型果蔬保鲜剂的研究也鲜有涉及，以及椒蒿精油单个组分及几种组分复合作用的抑菌效果仍需进一步研究。全面掌握椒蒿精油抑制微生物生长的确切组分和机制，将扩大椒蒿精油的综合利用。

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（责编：张宏民）