一种纯化培养腐烂茎线虫的方法

毛佳 曹凯歌 章安康 汪国莲 孙厚俊 王宏宝

摘 要：腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）系世界上一种重要的植物病原线虫。试验通过甘薯培养皿接种法、薯条离心管接种法、薯块切片打孔接种法等3种方法比较线虫培养方面的优缺点，筛选出以甘薯切片打孔接种法，接种已受孕单条雌虫为接种对象的培养体系。该体系为高纯度培养纯化腐烂茎线虫提供新思路，同时也为系统研究腐烂茎线虫个体遗传学及个体发育学等学科提供技术参考。

关键词：腐烂茎线虫;纯化培养;甘薯

中图分类号 S432文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）16-0080-03

Abstract：Ditylenchus destructor is an important plant pathogenic nematode in the world. In this experiment，the advantages and disadvantages of nematode culture were compared by three methods： sweet potato culture dish inoculation method，potato centrifugal tube inoculation method and potato slice drilling inoculation method. A culture system was screened，in which sweet potato slice drilling inoculation method was used to inoculate a single pregnant female. This system provided a new idea for high purity culture and purification of rotten stem nematode，and also provided a systematic study of rotten stem nematode. Individual genetics and ontogeny provide technical references.

Key words：Ditylenchus Destructor;Purification training;Sweet potato

甘薯腐烂茎线虫病是我国农业上的重要病害，在国内主要分布于河南、河北、山东、山西、安徽、江苏等省区。其病原物甘薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）最早在马铃薯上发现，导致马铃薯腐烂[1]。

甘薯茎线虫病是我国甘薯产区的重要病害之一，其病原腐烂茎线虫是我国重要的检疫性对象。近年来由于甘薯生产上引种不当，造成甘薯茎线虫病的大面积蔓延，该病害是由线虫危害引起的，病原经南京农业大学丁再福等[2]鉴定是马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor），这是植物寄生线虫中唯一引起植物干腐症状的病原物，甘薯受到马铃薯腐烂茎线虫的侵染，轻者减产10%～30%，重者达50%～80%，甚至绝收[3]。该线虫除了危害马铃薯、甘薯，还危害胡萝卜、花生、薄荷等。

通过简单和易操作的方法获得群体纯度高、生命力良好的线虫是系统研究该线虫的生物学特性、致病机理、种群群体及个体的遗传变异等工作的基础和前提。目前系统进行纯化培养该线虫的方法，一般通过下述几种渠道获得。如在PDA平板中接入茄腐镰刀菌，灰葡萄孢和毛壳菌，25℃温箱中暗培养腐烂茎线虫，另外，刘斌等人报道采用玉米培养基培养的灰葡萄孢对腐烂茎线虫进行单异活体培养，在室内可以快速大量繁殖腐烂茎线虫，阮龙等人报道采用甘薯发根单寄主培养体系繁殖腐烂茎线虫的方法，上述纯化培养方法都是通过接種大量线虫获得成功，且纯化成功的基础是在大量接种前进行腐生线虫等其它虫体的去除，因此，建立1种快速、高效培养腐烂茎线虫的方法是本研究的重点。

1 材料与方法

1.1 线虫种群 供试腐烂茎线虫群体来自河南洛阳的DeYL群体。所用薯块品种为苏渝303。

1.2 线虫的准备 在40×体式显微镜下用线虫针挑取线虫种群雌虫放在玻片上，并转到100×显微镜下进一步确认无误后，收集到凹面皿中备用。

1.3 纯化培养方法

1.3.1 薯片培养皿接种法 将切好的薯片放在琼脂糖凝胶平板中用于接种线虫。平板中的薯片中心位置（事先用灭菌刀切1个小口）分别接种50条，20条，10条，5条、2条线虫，之后将平板封口后置于25℃培养箱中培养30d后观察结果[4-5]。

1.3.2 薯条离心管接种法 在离心管里注入20vl无菌水后将线虫挑入其中，将打孔器打下的薯条用灭菌刀切下约2～3cm部分置于2ml离心管内，培养温度、时间同1.3.1。

1.3.3 薯块切片打孔接种法 将整薯纵向切去1/3，留下的部分用打孔器打孔，孔间距约3cm，在接入线虫之前，先在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出小孔为准。将线虫接到小孔内，将切下的部分薯块做为天然保湿盖盖在处理过的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，皮筋捆绑后平放在培养箱里，在储藏盒内预先喷施少量无菌水，以保持薯块湿润的生长环境，以利于线虫的生长发育。

线虫自交纯化培养方案中，采用上述3种接种方法，将线虫种群的1条大龄幼虫和2条雄虫接入接种点（小孔、皿中心接种点、离心管底部）中自交。将每次处理置于计数皿中分离观察。单条受孕雌虫线虫纯化培养法采用线虫薯块切片打孔法，即将线虫种群的1条受孕雌虫用线虫针接入打好孔的薯块中，接入线虫后用石蜡封口。以上线虫培养方案均在25℃培养箱中培养30d后观察统计线虫繁殖情况[4-5]，每个处理重复20次。

1.4 结果统计与数据处理 对原始数据应用excel和DPS统计软件处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同接种数量对线虫繁殖的影响 由表1可知，采用1.1.3法，接种50条，20条，10条，5条线虫1个月后均能查到有后代产生。接种2条线虫自交成功率为20%，表明在平板薯片上接种少量线虫仍可以产生后代。

2.2 不同接种方法对腐烂茎线虫繁殖的影响 由表2可知，3种接种方法均能成功纯化培养腐烂茎线虫，比较发现，切片打孔接种法比较实用，同时培养产生的后代数量多，自交繁殖数量为137.4，在P0.05达到显著水平，自交成功率也较高为50%;其它2种方法培养的线虫后代数量和自交成功率均较低。腐烂茎线虫不存在孤雌生殖现象，其繁殖后代只能通过有性生殖进行。

甘薯培养皿接种法的的缺点是占用的甘薯材料多，尤其对于一些稀缺的甘薯材料;离心管里薯条接种法优点是灵巧、方便可以进行大量接种，需要薯块材料少，便于线虫集中在一起，增加线虫自交的几率，缺点是在培养后期，薯块体积小、薯皮表面积少，加快薯条水分的损失，再加上线虫自身对其造成的伤害会使薯条加速老化腐烂，进而影响线虫生存。而甘薯切片打孔接种法以繁殖数量大，自交成功率高，所用甘薯材料保存完整，微环境更接近原始生存环境为优点，经筛选确定甘薯切片打孔接种法为优化培养腐烂茎线虫的载体。

2.3 一种纯化培养腐烂茎线虫体系的优化 由表3可知，单雌纯化培养与该线虫自交相比，纯化繁殖成功的概率显著增高，达65%，培养30d后分离观察后代平均数量为84.15，比亲本自交平均繁殖后代数137.4 在P0.05水平上显著降低，分析认为可能在单条雌虫接种之前部分卵块已经排出体外所致。研究也发现2种方法所分离到的线虫群体整齐度相对均一，但采用单雌纯化繁殖所需工作量相对较少，约为2h;而采用线虫亲本自交的工作量相对较大，约为4h;因此，从简便高效，容易快速纯化获得后代的角度出发，采用甘薯切片打孔法接种受孕单条雌虫作为纯化培养腐烂茎线虫群体的方法。

3 讨论

目前，有关学者对腐烂茎线虫纯化培养研究的并不多，纯化培养马铃薯茎线虫的方法大多在真菌上繁殖[6]。腐烂茎线虫是1种杂食性线虫，既可以在许多寄主植物的根、块根和块茎上寄生危害，也有食菌的特性。据报道，在无高等植物的情况下，该线虫能够在大约40个属70种真菌上繁殖[7-8]。刘斌等人报道通过用玉米培养基培养的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），对腐烂茎线虫进行的单异活体培养，在室内可以快速、大量繁殖腐烂茎线虫[6];阮龙等人报道甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫是可行的，且优于胡萝卜发根繁殖马铃薯腐烂线虫体系。上述繁殖方法对于快速大量繁殖线虫带来了便利，但若腐烂茎线虫在真菌上长时期繁殖培养（寄主发生改变的情况下），可能在致病力等生物学特性方面发生转变，因此，建立用甘薯（原寄主培养）来进行纯化培养线虫显得非常重要。

本试验比较了甘薯培养皿接种法、薯条离心管接种法、薯块切片打孔接种法的优缺点，筛选出以甘薯切片打孔法接种受孕单条雌虫来纯化培养腐烂茎线虫群体，为研究腐烂茎线虫不同种群单雌繁殖力等生物学特性提供技术参考，同时也为研究腐烂茎线虫群体遗传学、生物学，个体遗传学及个体发育学等方向提供重要的技术支持。

参考文献

[1]Thorne G. Ditylenchus destructor n. sp.，the potato rot nematode，and Ditylenchus dipsaci（Kuhn，1857）Filipjev，1936，the teasel nematode （Nematode：Tylenchidae） [J]. Proc Helm in Soc，1945，12（2）：27-33.

[2]丁再福，林茂松.甘薯、馬铃薯和薄荷上的茎线虫的鉴定[J].植物保护学报，1982，9（3）：69-172.

[3]周忠，马代夫.甘薯茎线虫病的研究现状和展望[J].杂粮作物，2003，23（5）：288-290.

[4]林茂松，贺丽敏，文玲.甘薯形态结构对茎线虫病的抗性机制[J].中国农业科学，1996，29（3）：8-12.

[5]林茂松.室内人工接种测定甘薯品种对马铃薯腐烂线虫的抗性[J].南京农业大学学报，1989，12（3）：44-47.

[6]刘斌，郑经武.腐烂茎线虫单异活体繁殖方法研究[J].浙江农业学报，2006，18（6）：445-447.

[7]Faukner L R，Darling H M.Pathological histology，hostsand culture of the potato rot nematode[J]. Phytopathology，1961，5（11）：778-785.

[8]Doncaster C C. Nematode feeding mechanisms. 2. Observations on Ditylenchus destructor and D.myceliophagus feeding on Botrytis cinerea[J]. Nematologica. 1966，12：417-427.

（责编：杨 林）