半夏生物碱提取方法及抗氧化性研究

2019-10-08郭春延薛晶晶楚建周姚晓芹

实验技术与管理 2019年8期

张楠，郭春延，薛晶晶，楚建周，姚晓芹

（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.属于天南星科多年生草本植物，广泛分布于中国、日本和韩国的大部分地区。半夏已在中国传统医学中使用了2000多年[1]，并被记录在中国药典中[2]，是治疗咳嗽，呕吐，感染和炎症的常见中药[3-4]。

半夏块茎含有多种化学元素，先前关于半夏块茎化学成分的研究表明，生物碱是半夏的主要活性成分[5]，在许多生理功能中具有显著的生物活性。因此，生物碱可以作为半夏质量控制指标之一。

半夏生物碱含量测定及其抗氧化性研究是我院大学生综合性实验之一。传统提取生物碱含量方法为索氏提取和旋转蒸馏法[6]，但这两种方法在提取过程中不仅耗能，而且耗时，并且需要配备多台索氏提取器和旋转蒸发仪。本文主要研究了不同提取方法对半夏生物碱含量的影响，并对半夏生物碱的抗氧化性进行分析，提出了一种生物碱优化提取的改进方法。该方法简便、快速、准确，可用于评价半夏品质，同时也可以应用于大学生综合性实验中。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器和试剂

材料：半夏块茎于2017年9月10日购买于甘肃省陇南市西河县（北纬 34°02′，东经 105°3′，海拔1500 m），半夏块茎的直径约为0.5～2.0 cm，于60 ℃烘箱中干燥，用粉碎机粉碎成粉末，并过60目筛，装在自封袋中备用。

仪器：电热鼓风干燥箱（GZX-9140MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂），紫外分光光度计（722型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司），数控超声波清洗器（PS-40A型，功率240 W，深圳市康杰洗净电器有限公司），电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），水浴锅（金坛市晶波实验仪器厂），离心机（Multifuge 1S-R D-37520 Osterode made in Germany）等。

试剂：盐酸麻黄碱（NICPBP，171241-201508），氨水，氯仿，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，溴麝香草酚蓝溶液，邻苯三酚，Tris-HCl缓冲液，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，抗坏血酸，邻二氮菲，过氧化氢，硫酸亚铁，乙醇，1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）等。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液制备

精准称取 105 ℃下干燥至恒重的盐酸麻黄碱标准品10.4 mg，于100 mL容量瓶中用蒸馏水溶解，配制成含有0.104 g/L浓度的盐酸麻黄碱溶液。

1.2.2 标准曲线绘制

准确量取盐酸麻黄碱溶液标准品0.2，0.35，0.50，0.65，0.80 mL置于分液漏斗中，分别加蒸馏水至1.0 mL；将10 mL、pH 5.40的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，1 mL、质量分数为0.1%溴百里酚蓝溶液和10 mL氯仿依次加入分液漏斗中；振荡1 min后将混合物静置1 h。于416 nm波长下测量氯仿层的吸收值。

1.2.3 不同提取方法

将0.5 g半夏粉末与0.5 mL、体积分数为25%氨水和5 mL氯仿混合，采用5种不同的提取方法提取得样品溶液：（1）冷浸24 h；（2）超声1 h；（3）热浸24 h；（4）超声1 h和冷浸24 h；（5）冷浸24 h和超声1 h。

1.2.4 提取时间和温度对生物碱含量的影响

在1.2.3节中筛选出最佳提取方法的在此基础上，进一步单因素分析了提取时间和提取温度对生物碱提取的影响。提取时间设置6个水平：1 h，3 h，6 h，12 h，24 h。提取温度设置4个水平：25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃。

1.2.5 生物碱的测定

生物碱含量的测定参考文献[7]的方法并稍作修改。生物碱提取溶液5000 r/min离心5 min，将2 mL提取液、8 mL氯仿、10 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.40）和1 mL 0.1%溴麝香草酚蓝溶液混合，振荡1 min后将混合物静置1 h。于416 nm波长下测定包含生物碱的氯仿层溶液吸收值。

1.2.6 稳定性，精密度和回收率测定

室温下5 h内每隔1 h对半夏样品溶液进行测定，用相对标准偏差（RSD）表示样品的稳定性。对5份样品溶液分别连续测定10次，用相对标准偏差（RSD）表示方法的精密度。通过回收测试法研究该方法的准确性，用回收率表示。

1.3 抗氧化能力的测定

1.3.1 超氧阴离子自由基清除率的测定

超氧阴离子自由基清除率测定采用文献[8]的方法并进行少量修改。将1 mL样品溶液、4 mL Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.2）和1 mL邻苯三酚溶液（0.2 mmol/L）混合，置于25 ℃水浴锅中保温4 min；用2滴浓HCl终止混合溶液反应，于325 nm波长下测定吸光度。超氧阴离子自由基清除率γ1计算如下：

其中，A0是对照溶液的吸光度，As是样品溶液的吸光度。

1.3.2 羟基自由基清除率测定

羟基自由基清除率测定采用文献[9]的方法并进行少量修改。将1 mL样品溶液、1 mL邻二氮菲溶液（0.75 mmol/L）、2.0 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L pH 7.4）、1 mL硫酸亚铁溶液（0.75 mmol/L）和1 mL H2O2（0.01%）混合，37 ℃水浴锅下保温60 min，于536 nm下测量吸光度。羟自由基清除率γ2计算如下：

式中，As为半夏样品溶液的吸光度值，A1为无样品溶液的吸光度值，A2为无样品溶液和H2O2的吸光度值。

1.3.3 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率采用文献[10]的方法并稍作修改。将2 mL DPPH溶液加入到2 mL样品溶液中，并在室温且黑暗中静置30 min，于517 nm样品溶液吸光度。DPPH自由基清除率γ3计算如下：

式中，A0为对照溶液的吸光度值，As为样品溶液的吸光度值，A3为无DPPH的吸光度值。

1.3.4 数据分析

采用 SPSS（Statistical Package for the Social Science）13.0软件对数据进行方差分析和显著性检验（p＜0.05），采用 Excel 2007作图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

图1表明盐酸麻黄碱标准品与吸光度的关系，以盐酸麻黄碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为y= 8.0584x+ 0.0141，R2=0.9961（n= 5）。

图1 标准液浓度-吸光度曲线

2.2 提取方法对半夏块茎中生物碱含量的影响

半夏生物碱经碱化后用氯仿溶液提取，提取方法一般包括超声提取、回流提取、冷浸等。游素碧等[11]的实验结果表明，冷浸提取和超声提取对半夏生物碱提取率的影响差异不显著。李婷[12]报道回流提取和超声提取方法对生物碱含量没有显著影响。本研究提出一种热浸提取生物碱的方法，并且和低能耗的超声波和冷浸提取方法进行比较。5个重复的平均值见图2，图2表明，不同提取方法对半夏生物碱提取率由高到低依次为：C3（热浸24 h）的提取率＞ C2（超声1 h）的提取率＞ C4（超声1 h和冷浸24 h）的提取率＞ C5（冷浸24 h和超声1 h）的提取率＞ C1（冷浸24 h）。

图2 提取方法对半夏生物碱含量的影响

2.3 热浸时间和温度对半夏生物碱含量的影响

由图2可知，本实验条件下筛选出的半夏块茎生物碱最佳提取方法为热浸，在此基础上本文进一步研究了热浸时间和温度对生物碱提取的影响。由图3可知，35 ℃下提取时间对半夏生物碱含量没有显著影响。因此推荐1 h。

图 4表明，提取温度在 35 ℃和 40 ℃下，半夏块茎生物碱含量明显高于 25 ℃和 30 ℃下半夏块茎中生物碱含量，并且生物碱含量在提取温度 35 ℃和40 ℃之间没有显著差异。因此，提取生物碱的最佳热浸温度推荐35～40 ℃。

图3 提取时间对半夏生物碱含量的影响

图4 提取温度对半夏生物碱含量的影响

2.4 稳定性、精确度和回收率

样品溶液按照最佳提取方法进行提取和测定，于416 nm下每隔1 h连续测量样品溶液5次。结果表明，样品溶液在5 h内RSD值为0.341 %（n= 6），表明稳定性符合有关规定。

取标准液3.0 mL，按照1.2.5节方法进行测定，在416 nm波长下连续测定10次的RSD = 0.052%，表明测试精密度很好。

精确称取半夏块茎粉末5份，每份0.5800 g，准确加入质量浓度为1.3×10-5g/mL 10 mL盐酸麻黄碱标准品溶液，按最佳提取方法进行提取，其结果平均回收率为102.6%。

2.5 半夏块茎抗氧化分析

生物体内活性氧类物质是生物有氧代谢过程中的一种副产品，包括超阳阴离子、羟自由基等含氧自由基，也包括过氧化氢、单线态氧等非自由基形式的含氧分子[13-14]。正常情况下，植物体内的活性氧类物质代谢处于动态平衡[15]。然而，各种生物或非生物胁迫能够扰乱细胞的代谢平衡，从而导致活性氧类物质积累，高浓度的活性氧类物质对生物有机体极其有害。另外，DPPH自由基是一种稳态的氮中心自由基，广泛用来评估抗氧化剂的自由基清除活性[16-17]。本文通过对半夏生物碱的超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基的清除能力测定可知，半夏DPPH自由基清除活性显著高于超氧自由基清除活性和羟自由基清除活性（见图5），证明半夏的DPPH自由基清除能力强于其他两种自由基清除能力。