RIP3在垂体腺瘤病理组织中的表达及意义

肖德勇　郑广顺　林昆哲　魏梁峰　王守森

【摘要】 目的：探讨受体相互作用蛋白-3（RIP3）在垂体腺瘤病理组织中是否表达及其亚细胞定位，分析RIP3表达是否与垂体腺瘤卒中囊变、侵袭性等生物学行为存在相关，为垂体腺瘤的临床治疗和预后分析提供新的思路或探索途径。方法：连续收集经临床手术+病理证实的垂体腺瘤128例，按术前MRI影像分为实质性组、囊变无液平面组和囊变伴液平面组，免疫组化技术检测RIP3蛋白表达，结合临床和影像资料进行统计学分析。结果：RIP3蛋白主要表达在胞核，胞质中表达量少，呈棕黄色染色。囊变伴液平面组垂体腺瘤阳性表达率高达88.9%，均较实质性组和囊变无液平面组高（P<0.05）。RIP3阳性表达率与垂体腺瘤侵袭性无关（P>0.05）。结论：RIP3在垂体腺瘤组织中存在阳性表达，主要表达在细胞核，阳性表达可能与垂体腺瘤出血性卒中有关，可为垂体腺瘤的研究提供新的探索途径。

【关键词】 垂体腺瘤; 垂体卒中; 受体相互作用蛋白3; 免疫组化; 病理; MRI

Expression of Receptor Interaction Protein-3 in Pituitary Adenomas/XIAO Deyong，ZHENG Guangshun，LIN Kunzhe，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：00-005

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of receptor interaction protein-3（RIP3）in pituitary adenoma patients pathological tissues and the sub-cellular localization，and to investigate the relationship of the expression of RIP3 and biological behaviors such as cystic changes and invasiveness in pituitary adenomas，providing new ideas or methods for clinical treatment or prognosis analysis for pituitary adenomas.Method：RIP3 expression in 128 continuous cases of the pituitary adenoma pathological tissues was detected by immunohistochemmistry，who were divided into three groups according to the preoperative MRI images：substantive group，cystic without fluid level group and cystic with fluid level group.The expression of RIP3 was statistical analysis combined with clinical and imaging data.Result：There were RIP3 expresses in the PA pathological tissues，which mainly located in nucleus but weekly in cytoplasm，showing brownish yellow staining.The positive expression rate in cystic with fluid level group was as high as 88.9%，which was higher than those of other groups（P<0.05）.The positive expression rate of RIP3 was not associated with the invasiveness of pituitary adenoma（P>0.05）.Conclusion：There is RIP3 expression in pituitary adenoma pathological tissues，which is mainly expressed in the nucleus.The RIP3 expression may be related to hemorrhagic stroke of pituitary adenoma，which may provide a new exploration method for the study of pituitary adenomas.

【Key words】 Pituitary adenoma; Pituitary apoplexy; Receptor interaction protein 3; Immunohistochemistry; Pathology; MRI

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Xiamen Medical College，Xiamen 362100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.001

垂體腺瘤是颅内常见的良性肿瘤，约10%呈侵袭性生长，0.6%～9.1%的垂体腺瘤可发生卒中[1-2]。目前，有关垂体腺瘤卒中、囊变、侵袭性等生物学行为的病理机制尚未明确，需要进一步寻找更为有效和可靠的分子病理学指标，为临床诊疗及预后评价提供指导。基础研究证实，受体相互作用蛋白-3（receptor-interacting proteins 3，RIP3）基因定位于人染色体14q11.2上，该区域的染色体损伤与肿瘤发生发展相关[3-4]。RIP3不仅能够诱导细胞凋亡，在细胞程序性坏死（programmed necrosis）过程中也有极重要的作用，调控着细胞凋亡与细胞坏死相互转换的关键环节[5-6]。近年来，RIP3在肿瘤研究中逐渐受到关注，但在垂体腺瘤中尚未见相关的国内研究报道，RIP3的亚细胞定位目前也尚无定论。垂体腺瘤卒中、囊变是由垂体腺瘤继发出血或缺血梗死导致的，也存在程序化坏死的特征。本研究采用市售抗RIP3抗体，免疫组化检测RIP3在人垂体腺瘤病理组织中是否表达及亚细胞定位，分析RIP3表达是否与垂体腺瘤卒中囊变、侵袭性等存在相关。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月-2017年6月本科收治的垂体腺瘤手术患者共128例，其中男

62例，女66例;年龄7～76岁，平均（45.56±13.91）岁;微腺瘤2例，大腺瘤74例，巨大腺瘤（直径≥4.0 cm）52例;侵袭性腺瘤64例，非侵袭性腺瘤64例。纳入标准：手术+免疫组化确诊垂体腺瘤;均行经鼻蝶入路手术;MRI影像和临床、病理资料完整。排除标准：术前有放疗史;再次手术患者。所有研究对象均签署知情同意书和保密协议书，该研究已经伦理学委员会批准。

1.2 MRI检查评估与血清垂体内分泌激素检测 所有研究对象均采用Siemens 3.0T磁共振机，行垂体MRI平扫+增强扫描。对比剂采用钆喷酸葡胺注射液（Gd-DTPA），剂量为0.2 mmol/kg体重。根据术前MRI影像所示，分为：实质性垂体腺瘤63例，囊变无液平面垂体腺瘤29例，囊变伴有液平面形成垂体腺瘤36例。所有研究对象的血清垂体内分泌激素均由本院检验科分别测定，包括TSH、T3、T4、FT3、FT4、LH、FSH、PRL、ACTH、GH、E2、睾酮、皮质醇等。

1.3 免疫组化检查 采用市售兔抗人RIP3多克隆抗体（abcam公司）。二抗：KIT-9901即用型免疫组化试剂盒（鼠/兔）（福州迈新生物有限公司）。DAB显色剂：浓缩DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。所有石蜡包埋组织做3～4 μm厚切片，常规脱蜡、水化，行SP法（链霉素亲生物素-过氧化物酶法）免疫组化染色。

对照：阳性对照以本院病理科脾组织标本进行同法染色（外伤性脾切除术后）和结合abcam公司提供的阳性图片，阴性对照以PBS液代替一抗作阴性对照。证实市售抗RIP3抗体的可用性及实验方法的可靠性，确定实验结果可信。

结果判定，阳性表达：光镜下，境界清楚，位于细胞核和/或细胞质内的棕黄色或棕褐色颗粒。无棕黄色颗粒者为阴性细胞。所有结果由两位不知情的病理科医师进行判断，高倍镜下（×400）随机选取5个视野，参照Birner等[7]方法进行半定量分级，以阳性细胞率和染色强度的得分之和进行判断。阳性细胞率<10%记为阴性，不论其染色深浅，计1分，阳性细胞率11%～50%计2分，51%～80%计3分，>80%计4分。染色强度：呈轻度染色（淡黄色）计1分，中度染色（棕黄色）计2分，深度染色（棕褐色）计3分。上述两项积分之和为3分者为弱阳性（+），4～5分者为中等阳性（++），6～7分者为强阳性（+++）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0軟件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIP3在垂体腺瘤病理组织中的免疫组化及亚细胞定位结果 128例研究对象中，93例呈现RIP3的阳性表达，阳性表达率为72.7%（93/128）。垂体腺瘤组织中RIP3蛋白主要表达在胞核，少部分在胞浆有少量表达，光镜下呈现棕黄色染色，见图1。

2.2 RIP3表达与垂体腺瘤卒中囊变间的关系 根据

术前MRI分类，本组实质性垂体腺瘤63例，囊变无液平面垂体腺瘤29例，囊变伴有液平面形成垂体腺瘤36例。囊变伴液平面组垂体腺瘤的阳性表达率高达88.9%，均较实质性组（69.8%）和囊变无液平面组（58.6%）高，差异有统计学意义（字2=7.902，P=0.019<0.05），见表1。典型病例1，男性，20岁，术前MRI示垂体腺瘤，大小约3.0 cm×2.0 cm×2.2 cm，肿瘤卒中囊变，囊腔内见一个液平面形成，RIP3蛋白主要表达在胞核，呈棕黄色染色，强阳性（+++），见图2。典型病例2，男性，46岁，术前MRI影像示垂体腺瘤，大小约2.1 cm×3.0 cm×1.5 cm，瘤内见散在细小斑点状的短T1、短T2信号影，肿瘤侵犯蝶窦，周边强化，中央区无强化，RIP3表达呈阴性（-），见图3。

2.3 RIP3表达与垂体腺瘤侵袭性之间的关系 本组侵袭性腺瘤64例，非侵袭性腺瘤64例。侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤的RIP3蛋白阳性率分别为76.6%（49/64）和68.8%（44/64），两者比较差异无统计学意义（字2=0.983，P=0.321>0.05），见表2。

3 讨论

3.1 RIP3在垂体腺瘤研究中的意义 目前认为，机体存在三种死亡方式，即细胞凋亡（apoptosis）、细胞自嗜（fautophagy）和细胞坏死（necrosis）。近年越来越多的研究证据表明，在一定条件下细胞坏死也可以被调控—坏死性凋亡或程序化坏死（necroptosis），它是一种caspase非依赖性细胞死亡方式。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）被认为参与诱导细胞的程序化坏死，而RIP3则是调控TNF-α诱导的细胞坏死的关键调控蛋白—“驱动阀（trigger）”或“分子开关”[8-9]。这一发现被认为是为临床治疗脑缺氧、心缺血、动脉粥样硬化等与细胞坏死相关疾病的防治提供了新的思路。假如有效抑制RIP3的活性，就能在一定程度上抑制细胞坏死，对那些由细胞坏死导致的疾病就能起到治疗、防御或缓解的效果。

垂体腺瘤卒中、囊变是由出血或缺血梗死导致的，也存在着细胞缺血、缺氧、坏死。垂体腺瘤出血、囊变及其引起的生物学行为变化，很可能也与TNF-α和RIP3介导的垂体细胞损伤或坏死有关。而囊变伴液平面征象被认为是垂体腺瘤出血性卒中的特有表现[10]。本组128例垂体腺瘤的研究结果显示，RIP3在垂体腺瘤中存在阳性表达，阳性表达率为72.7%，囊性伴液平面的垂体腺瘤中表达量高达88.9%，比实质性垂体腺瘤高，而RIP3的阳性表达与垂体腺瘤是否具有侵袭性未发现明显关系，这是首次将RIP3应用在垂体腺瘤中的研究。目前国际上关于RIP3的研究尚处于起步阶段，它的许多功能以及它所参与的通路仍不清楚，RIP3如何实现调控细胞凋亡与坏死转换的问题仍有待进一步的探索。

本研究结果显示，囊变伴液平面组RIP3蛋白阳性率明显较高，这表明RIP3蛋白可能在垂体腺瘤出血性卒中的发生、发展过程中发挥作用，肿瘤细胞中RIP3表达增加，进而启动肿瘤细胞的坏死凋亡。Fortes等[11]也认为，出血性损伤引起的细胞死亡表现出程序化坏死的特征，游离的亚铁血红素有促炎症反应和细胞毒作用，其细胞毒作用造成细胞膜破坏和氧化应激反应，TNF-α和RIP蛋白可能在这种亚铁血红素诱导的细胞程序化坏死中发挥重要作用。

3.2 RIP3的研究概况 RIP3是RIP丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一，拥有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，具有自磷酸化、诱导细胞凋亡和激活NF-kB的作用。过量表达RIP3基因可诱导细胞凋亡是最早关于RIP3的生物学功能报道[12-13]。

而近年的研究认为，RIP3蛋白是TNF-α诱导下细胞发生凋亡还是坏死的关键调控蛋白，在非caspase酶依赖性的细胞坏死中发挥重要作用[14-16]。

它是细胞重要的应激传感分子，能根据不同应激信号，启动和调控细胞应激反应，决定细胞走向凋亡、坏死或存活等不同生存发展方向，也就是能感受细胞内环境变化，进而调控细胞的死亡或存活[17-21]。

RNA印迹分析显示，RIP3广泛表达于人的心脏、脑、胎盘、骨骼肌、肾、胰腺、脾、外周血淋巴细胞、前列腺、结肠等組织中。染色体研究显示，rip 基因定位于人类染色体14q11.2，小鼠染色体14B1。但其亚细胞定位，目前研究尚无统一的定论，免疫荧光分析显示，外源转染表达的RIP3蛋白以点状形态定位于线粒体。在HeLa细胞中外源表达的RIP3定位于细胞质，而突变分析显示RIP3蛋白可在细胞质和细胞核中穿梭，是一种细胞核质穿梭蛋白[22]。

3.3 RIP3在垂体腺瘤组织中的表达及亚细胞定

位 本组128例垂体腺瘤的免疫组化研究结果证实，在人垂体腺瘤病理组织中存在RIP3蛋白的表达，并且进一步提示RIP3蛋白的亚细胞定位在细胞核和细胞质，且主要表达于细胞核，与其相比，在细胞质的表达明显较弱。这一研究结果对RIP3的亚细胞定位在细胞核和细胞质，并且存在核质穿梭现象提供了证据，研究结果与Yang等[23]的报道基本吻合。现有的研究数据提示，RIP3蛋白的亚细胞定位可能与细胞的不同生理病理过程有关，并随着定位的改变RIP3蛋白可能发挥不同的作用。

本研究结果提示，RIP3蛋白表达与垂体腺瘤侵袭之间未发现明显相关。分析原因，可能与下列因素有关：（1）本研究采用的病理组织蜡块，标本的采集、保存等过程中可造成结果影响;

（2）采用新鲜标本组织，RT-PCR或Weston blot等检测手段，结果可能更精确。本研究是国内首次将RIP3应用于垂体腺瘤的研究，其与垂体腺瘤的发生、发展、生物学行为关系等的意义还需要进一步研究。

综上所述，本实验结果证实在垂体腺瘤病理组织中存在RIP3蛋白的阳性表达，RIP3主要表达在细胞核。囊变伴液平面组垂体腺瘤的RIP3阳性表达率高于实质性垂体腺瘤，提示RIP3蛋白阳性表达程度可能与垂体腺瘤出血性卒中有关。进一步开展RIP3在垂体腺瘤中的相关研究，有望为研究垂体腺瘤的生物学行为提供新的探索途径，为垂体腺瘤的临床诊疗提供新的思路。

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