浅谈离体血管环实验

程香 孙霞 刘英光

【摘 要】2016年，中国心血管病死亡率居首位，高于肿瘤及其他疾病。脑血管病、冠心病、外周动脉疾病等血管性疾病在心血管病中占据着重要地位。离体血管环实验是研究血管舒缩功能的一种实验方法。通过对血管舒缩功能研究，探讨血管疾病的本质，从而为心血管疾病的防治提供科学依据。本文从离体血管环实验简介、实验设备、实验步骤及实验中的经验总结等方面进行阐述，希望对即将开展该实验的研究人员提供一些帮助。

【关键词】离体血管环实验;血管功能;收缩;舒张

中图分类号： TH776.2 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）23-0220-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.23.104

【Abstract】In China， Cardiovascular Disease（CVD） was the leading cause of death in 2016， more than tumors or any other diseases.Cerebrovascular disease， coronary heart disease， and peripheral arterial disease occupy an important position in cardiovascular disease.The vascular ring experiment in vitro is an experimental method for the study of vasomotor contraction and relaxation.Through the study of vasomotor function， the nature of vascular diseases is explored to provide a scientific basis for the prevention and treatment of cardiovascular diseases. This article describes the introduction， devices， procedures and experience of the vascular ring experiment in vitro， hoping to provide some helps for researchers to conduct the experiment.

【Key words】The vascular ring experiment in vitro; Vascular function; Contraction; Relaxation

心血管系統疾病是世界范围内死亡的主要原因，但其发病机制尚不清楚[1]。调查显示，2016年，中国心血管病死亡率居首位，高于肿瘤及其他疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上。脑血管病、冠心病、肺血管病及外周动脉疾病等血管性疾病在心血管病占据着重要地位[2]。离体血管环实验是研究血管舒缩功能的一种实验方法，是研究血管生理学、病理生理学和药理学的重要手段[3]。通过对血管舒缩功能研究，探讨血管疾病的本质，从而为心血管疾病的防治提供科学依据。本文第一作者有幸作为“2018年中西部高等学校青年骨干教师国内访问学者”，于2018年9月到西安交通大学医学部生理学与病理生理学系进行为期10个月的访问学习，期间跟随心血管病理生理学研究团队，参与了大鼠、小鼠离体血管环实验，现就该实验基本内容、实验设备与器材、实验步骤及注意事项和在该实验中的经验等阐述如下。

1 离体血管环实验简介

离体血管环实验是研究血管舒缩功能的一种实验方法。实验装置不断推陈出新，目前使用较广泛的是DMT620多通道离体微血管张力测定系统（丹麦）（图1）。首先分离血管，清除周围结缔组织和脂肪组织，切成2-3mm长的血管环，再用金属丝或钨丝穿过血管环并悬挂于张力浴槽内，连接张力换能器和计算机，测定并记录离体血管的舒缩活动，常用于研究大鼠肠系膜动脉[4]、大鼠脑基底动脉[5]、小鼠肠系膜动脉[6]、小鼠主动脉、髂动脉、颈动脉、肾动脉[7]等微小血管的功能。

2 离体血管环实验设备、器材

离体血管环实验所需设备、器材包括：（1）动物解剖台;（2）手术解剖显微镜;（3）DMT620多通道离体微血管张力测定系统;（4）氧气瓶;（5）微型真空泵;（6）培养皿;（7）水浴锅;（8）常用动物手术器械;（9）移液器等。

3 离体血管环实验步骤及操作注意事项

（1）打开仪器设备，检查仪器状态。

（2）在DMT620多通道离体微血管张力测定系统张力浴槽内填充5ml预冷的（4℃）Krebs-Henseleit溶液（KHS），KHS成分（浓度/mM）：NaCl115，NaHCO325，KCl 4.6，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl22.5，Glucose.H2O10，充95%O2+5%CO2后用NaOH调至pH7.4[8]。注意此时不可加热。

（3）处死动物，解剖并分离组织，轻轻取出拟研究的血管组织，放置于含预冷的（4℃）KHS的容器中，稍微冲洗血管表面及管腔内部分血液。

（4）将血管组织转移至含预冷的（4℃）KHS的专用培养皿中，轻轻撑开血管并分离血管表面的脂肪及结缔组织等，尽量分离干净。

（5）剪切一段长约2mm的血管环，建议取中间段的或分支，两端的不要。

（6）将一根血管环转移至一个张力浴槽中。用金属丝（40μm）或钨丝（25μm）穿过血管环固定于张力浴槽内。

（7）血管环固定好后检查两根丝的位置，调至平行状态，血管环处于松弛状态，不受力。

（8）将固定有血管环的张力浴槽放置于主控制器面板上，插上传感器连接线。

（9）打开通气，使气泡一个接一个冒出，打开加热，升温至37℃。

（10）待温度上升至37℃后，拉至初始预张力。小鼠胸主动脉约5mN，大鼠肠系膜动脉约3mN。在此基础上，可根据血管粗细适当调整。

（11）更换5mL 37℃预热通气的KHS，开始平衡，平衡过程中每隔20min换一次张力浴槽内的溶液。平衡总计60min。在平衡过程中，每隔5min左右旋转螺旋尺调节初始值，使张力始终维持在最佳初始值附近即可。

（12）打开电脑软件，开始记录。

（13）调零（Zero）。排空浴槽中的KHS。排空后，立即加入5ml 60mM的高钾Krebs-Henseleit溶液刺激血管并添加注釋，刺激到上升至平台期。60mM的高钾KHS成分（浓度/mM）：NaCl63.7，NaHCO315，KCl60，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl21.5，Glucose.H2O 5.5，充95% O2+5%CO2后用NaOH调至pH7.4。

（14）使用37℃预热充气的KHS洗脱至基线。等待10min后再进行刺激。

（15）排空浴槽中的KHS。立即加入5ml 60mM的高钾KHS第二次刺激并添加注释，刺激到上升至平台期。按上一步骤的方法洗脱血管至基线。

（16）等待15min，添加1μM（5μL 1×10-3M至5mLKHS）收缩剂（去甲肾上腺素或苯肾上腺素），刺激至平台期，并维持在平台。

（17）添加乙酰胆碱10μM（5μL 1×10-2M至5mLKHS）。舒张2min。观察血管舒张程度，血管能够舒张至85%以上，表明血管内皮功能完好。

（18）如果需要做量效曲线，可以直接加收缩药，逐渐增加乙酰胆碱或其他舒张药的浓度，观察舒张曲线。

（19）用37℃预热充气的KHS洗脱血管3次，每次15min。

（20）根据实验设计，用药物孵育血管（15min）或不孵育，添加收缩剂，待收缩至平台期，浓度累积地加入不同的舒张药，观察舒张曲线。每组药物之间均按上一步骤的方法洗脱血管。

（21）结束实验，保存文件。

（22）清洗仪器。

4 离体血管环实验的体会

离体血管环实验比较耗时，从分离血管到实验结束，少则4-5h，多可达10h以上，非常考验实验人员的耐心。通过几个月的实验操作，现将实验过程中的经验总结如下，希望对今后开展此实验的研究人员提供一些帮助。

1）在分离血管时，一定要有耐心，切勿过度牵拉血管，否则易使血管失去活性。分离血管是一项技术活，要想得到活性好的血管，一定要多练，可以先分离直径较粗的胸主动脉，再过渡到肠系膜2级或3级血管。血管离体后，不能干燥，必须放置于盛有KHS的容器内。

2）血管分离后，将血管固定于张力浴槽时，注意勿损伤血管内皮，我们的经验是先穿过一根丝，固定到张力浴槽上，再穿第二根丝并固定。在穿第二根丝时，务必与第一根丝平行，不能有交叉。固定好后，要使血管处于松弛状态，不受力。

3）血管固定好后，调至初始预张力后平衡血管也是非常重要的过程，此过程使血管逐步适应离体环境，为后续血管功能测定奠定基础，若血管未平衡好，在加药时，血管会对药物的反应性差，影响实验顺利进行。因此，在调初始张力时，为了使血管逐渐适应，我们常常逐步升高张力，如初始张力为3mN，先调至0.5mN，稳定数分钟，再增加至1mN，稳定数分钟，直至到3mN。

4）加药时，合理掌握加药时间是极为重要的。（1）在加入收缩剂后，一定要达到收缩平台期后才能加舒张药，否则可能出现加入舒张药后，张力还继续升高的情况，无法分析到底是收缩剂还是舒张药的作用。（2）不同的血管，加药时间、间隔不能一概而论，实验中我们发现，加入相同浓度的苯肾上腺素，小鼠肠系膜动脉达到收缩平台期时间明显短于小鼠胸主动脉，故加药时间应相应缩短。（3）即使是相同类型的血管，由于不同浴槽内血管的反应性不同，也应认真观察，合理掌握加药时间，同为小鼠胸主动脉，同时加入相同浓度的苯肾上腺素后，如第一个浴槽内血管最先到达收缩平台期，则应先加舒张药至此浴槽，以此类推。

5）有时，血管张力曲线不稳定，要注意分析原因。如第一次加收缩药时，血管收缩不理想，可能血管未平衡好，还未较好地适应离体环境，可用37℃预热充气的KHS洗脱血管后，再平衡一段时间。

总之，做离体血管环实验是一个非常艰辛的过程，不仅要敢吃苦，还要善于开动脑筋，总结经验，合理优化实验设计，实验过程中要耐得住性子，合理掌握加药时间，使实验结果更能客观反映血管本身的状态及功能。

【参考文献】

[1]Zhang L，Wang Y，Li Y et al，Hydrogen Sulfide（H2S）-Releasing Compounds：Therapeutic Potential in Cardiovascular Diseases[J].Front.Pharmacol.9：1066.doi：10.3389/fphar.2018.01066.

[2]胡盛寿，高润霖，刘力生，等.《中国心血管病报告 2018》概要（R），中国循环杂志 2019 年 3 月 第 34 卷 第 3 期（总第 249 期）.

[3]介绍一种离体血管环的实验装置和方法[J].刘沙、萧明第、薛松、卢成宝，《医学研究生学报》，2002 年6月，第15卷 第3期，199-203.

[4]Wang XF， Cheang WS， Yang HX et al， Nuciferine relaxes rat mesenteric arteries through endothelium-dependent and-independent mechanisms[M]，British Journal of Pharmacology， （2015） 172 5609-5618.

[5]Yu Wei， Wang Yan， Song Zheng， Zhao Li-Mei， Li Gui-Rong， Deng Xiu-Ling.Equol increases cerebral blood flow in rats via activation of large-conductance Ca2+-activated K+ channels in vascular smooth muscle cells[M]，Pharmacological Research， http：//dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2016.03.015.

[6]Yang GD，Wu LY，Jiang B et al，H2S as a Physiologic Vasorelaxant： Hypertension in Mice with Deletion of Cystathionine γ-Lyase[M].Science.2008 October 24; 322（5901）： 587–590. doi：10.1126/science.1162667.

[7]Oliver BARETELLA， Sookja K CHUNG， Aimin XU et al，Endothelial overexpression of endothelin-1 modulates aortic， carotid， iliac and renal arterial responses in obese mice[M].Acta Pharmacologica Sinica （2017） 38： 498–512.

[8]Wang Y，Sun HY，Liu YG et al，Tyrphostin AG556 increases the activity of large conductance Ca2+-activated K+ channels by inhibiting epidermal growth factor receptor tyrosine kinase[M].J. Cell. Mol. Med. Vol 21， No 9， 2017 pp. 1826-1834.