恶性浆膜腔积液细胞块技术的应用分析

刘金松

恶性浆膜腔积液多出现在肿瘤疾病晚期[1-3]，具有病因复杂多样的特点，临床上由于患者的症状不典型，加上缺乏影像学证据，对肿瘤组织来源难以进行准确的判断，耽误诊治实际。临床对恶性浆膜腔积液进行检测可判断原发病灶，确定疾病类型。常规细胞学涂片应用于肿瘤疾病诊断中难以鉴别区分增生的间皮细胞及腺癌细胞，加上标本量少、含有血液成分等原因引起细胞检出量少、细胞变性，无法进行确认，因此造成误诊。为了提高诊断准确性，本次研究对细胞块技术在分子病理诊断中效果进行分析，选取本院2017 年9 月—2018 年8 月期间恶性浆膜腔积液患者70 例作为观察对象，以提高病理诊断准确率，内容如下：

1 资料和方法

1.1 一般资料

研究对象：我院收治的恶性浆膜腔积液患者70 例（属于2017 年9 月—2018 年8 月期间）。男、女性患者分别为38 例、32 例；年龄范围23～88 岁，平均（53.96±1.50）岁。疾病类型：肝癌2 例，肺癌30 例，肠癌10 例，胃癌11 例，胆管癌7 例，乳腺癌10 例。所有患者与本次研究中各项标准及条件相符合，患者均知情本次研究内容，并自愿签署了知情同意书，并积极配合本次研究。

1.2 方法

70 例患者均进行恶性浆膜腔积液细胞块分子病理诊断，细胞块制作方法：在室温下放置恶性浆膜腔积液标本15 min，采用尖底离心管取容器底层标本50 mL，以2 500 r/min 的速度进行离心处理，时间为5 min，将上层清液分离出来，保留沉淀物于试管中，将10%中性甲醛8 mL 加入到放置沉淀物的试管中，室温条件下进行固定处理，时间为1 h 后，之后经离心处理，将上清取出，沉淀物使用滤纸进行包裹；当浆膜腔积液内沉淀物较少时，加入75%乙醇8 mL，静置30 min 使沉淀物凝固。使用吸管将细胞块吸取到显微镜试纸上，妥善包装好后，放入到自动脱水机中进行组织处理，将其制作成石蜡细胞块，细胞切片为3 μm、8 μm，于60℃下进行烘干，时间为1 h。

检测方法：（1）免疫组化染色：采用En Vision 两步法对3μm 的细胞切片进行染色，严格根据试剂盒相应说明步骤进行各项操作，单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司）为D 2-40、E-cad、Hep1、p 63、p 120、TTF-1、villin、CA 125、CK 5/6、CK7、CK 8/18、CK 19、CK 20、CKpan、CR。（2）荧光原位杂交（FISH）：采用蛋白酶K、GLP 探针对石蜡细胞块进行检测，按照FISH 说明书进行各项操作步骤，使用荧光显微镜对细胞荧光杂交信号进行观察，信号颜色为红色、绿色分别代表EGFR 基因、GSP7 探针，计数100 个细胞，对Ratio 值（胞核中红色信号数/绿色信号数）进行计算。（3）基因测序：在进行FISH 检测时同步进行基因测序。在1.5 mL EP 导管内加入3 片8μm 细胞切片，用Toyobo DNA试剂盒将消化组织提取出来，观察PCR 10μL 反应情况。取PCR第一次产物，再进行20μL 二次扩增体系，以琼脂糖凝胶1%行电泳测试，在紫外线下对扩增片段进行鉴定，过柱纯化PCR 产物，上机测序，对EGFR 基因第21、20、19 外显子以及第一内含子重复CA 次数进行测定。

1.3 观察指标及判定标准

免疫组化染色：将PBS 代替一抗作为阴性对照，阳性对照为阳性切片。

FISH 检测阳性标准[4]：（1）高多体型：红色信号细胞数量超过4 个，且所占比例超过总细胞数量40%，Ratio 指数＜2；（2）扩增EGFR 基因：成簇红色信号细胞超过15 个或超过总细胞数的10%，Ratio 指数≥2。阴性标准：Ratio 指数＜2。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

细胞块经免疫组化染色，可见清晰颗粒，且定位准确。如图1 所示：

图1 细胞块切片免疫组化染色（En Vision×200）

2.2 荧光原位杂交检测结果

70 例患者中FISH 阳性者为23 例，阳性率为32.86%，阴性率为67.14%（47/70）。阳性样本内EGFR 基因一共7 例，EGFR 扩增基因17 例。

2.3 基因测序结果

70 例患者中出现EGFR 突变9 例，突变率为12.86%。

3 讨论

恶性浆膜腔积液是肿瘤疾病晚期患者的常见并发症之一[5]，临床由于无典型症状及影像学证据缺乏，对肿瘤来源无法判断，会导致治疗时机被耽误。细胞病理诊断学以费用低、操作简单且安全无痛为突出性特征，且诊断快速、准确性高。

恶性浆膜腔积液是由血管导致组织液回流异常、癌栓淋巴管阻塞、癌细胞刺激等因素所致[6-8]，在人体各系统恶性肿瘤中均可观察到浆膜腔变化。以往采用细胞学涂片诊断构成中，由于细胞成团、细胞成分复杂、细胞腔强化不明显，加上增生腺癌细胞、间皮细胞等影响，导致鉴别难度较大，且阳性率低、重复性差[9]。而本次研究中将恶性浆膜腔积液内癌细胞制作成细胞块，可获取到较多的肿瘤细胞，结构清晰且相应组织学排列、结构均可完整保留。采用免疫组化染色法可对肿瘤进行分型诊断，细胞块保存时间长且可重复使用[10]，具有较高的定位准确率和阳性率。荧光原位杂交、基因测序可观察到EGFR 扩增情况、表达水平以及肿瘤细胞突变情况，便于临床筛选靶向药物，从而促进患者疗效的提高，延长生存期。本次研究中，将恶性浆膜腔积液支撑细胞块采用荧光原位杂交检测，其清晰的荧光信号可清楚地显示红绿对比，能够清晰观察到DAPI 复染细胞核的轮廓[11]，其应用在EGFR扩增（拷贝数增加）的检测中效果理想，但在EGFR-TKIs 的预测方面临床尚未统一观点。在采用EGFR-TKIs 为主的治疗方案中，分子靶向药物西妥昔单抗结合EGFR 蛋白可对信号通路进行阻滞[12]，进而发挥治疗效果，EGFR 扩增及其表达水平是对西妥昔单抗药物的效果进行评估的重要检测项目。通过基因测序能够对EGFR 突变进行检测[13]，说明晚期丧失手术治疗机会的肺癌患者从恶性浆膜腔积液中提取的DNA 也能够对EGFR进行检测，基因测序基本能够将所有突变发现，且对肿瘤组织进行基因测序，可对TKIs 治疗对象进行筛选，还可对治疗反应性进行预测。细胞块技术解决了无法获取肿瘤组织患者的诊治难题且具有较高的科学性和准确性[14]，其创伤性相较于病理组织活检而言更小。

总而言之，在恶性浆膜腔积液分子病理诊断中采用细胞块技术了提供有效的组织学分型、基因检测方法，从而有效鉴别诊断肿瘤疾病，为患者的靶向治疗方案提供指导。