miR-22靶向NLRP3基因对冠心病大鼠内皮细胞炎症损伤的影响研究

2019-09-27朴奇彦周秀明李中华

中国实验诊断学 2019年9期

朴奇彦，周秀明,李中华，孙娟

(吉林省前卫医院心血管内科，吉林长春130012)

冠心病临床中较为常见，是在脂质代谢异常影响下引发的动脉内膜脂类物质堆积，进一步引发动脉粥样硬化病变[1,2]。炎症反应作为心脏疾病中重要的作用机制之一，对于冠心病的发生和发展具有显著影响[3,4]。近年来，冠心病相关研究中，对于microRNA分子调控作用的关注显著提升，miR-22在冠心病发生发展中的作用逐渐纳入研究的范畴。此次研究选取22只健康SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠进行研究，明确miR-22靶向NLRP3基因对冠心病大鼠内皮细胞炎症损伤的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象与方法

22只健康SD雄性大鼠，鼠龄3个月-4个月，平均体重是(240.24±60.12)g，入组后大鼠均使用常规饲料喂养，正常饮水，在喂养7 d后，采取随机数字表法将入组的大鼠分成研究组和对照组，每组各11只，对照组大鼠不进行特殊处理，仍旧使用基础饲料与自来水喂养，研究组大鼠使用高脂饲料喂养，基础饲料占比94.30%，加入2%的胆固醇、3%的猪油、0.5%的胆酸钠和0.2%的丙基硫氧嘧啶，另外在高脂饲料喂养的基础上加入维生素D3粉剂，在研究实验开始时，在大鼠右下肢注射维生素D3粉剂，注射剂量是3×106U/kg体重，每30 d注射一次。实验持续3个月。入组大鼠的选取和应用均符合美国国家卫生研究院实验动物护理和使用指南要求，并通过伦理委员会审查。

1.2 实验方法

血钙和血脂的检测：采集大鼠腹部主动脉血，经过5 min的离心处理后，分离血浆，取1 ml进行血钙和血脂检测，使用生物化学分析仪检测大鼠的总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)和Ca2+的表达，重复三次检验，取平均值。

细胞的培养和转染方法：在无菌环境下，摘取大鼠的近心端冠状动脉，切下一部分组织进行RNA提取，剩余部分放到含双抗的磷酸盐缓冲液中进行清洗，300*g的频率离心处理10 min后，去除上清，使用20%FBS DEME-F12培养液进行培养，温度37℃，湿度适度，空气环境5%CO2。在实施转染的前一天，以2×105/cm2的密度，把待转染细胞接种到12孔板上，当细胞融合率达到60%-80%的范围时，按照转染试剂盒的说明要求实施miR-22 mimics转染，并进行相应的阴性对照，形成空白组(未转染细胞)、阴性组(转染不相干序列)、miR-22mimic组(转染miR-22过表达物)、miR-22 inhibi-tor(转染miR-22抑制物)组和miR-22 inhibitor+si NLRP3组(转染miR-22及失活NLRP3基因)，在验证转染效率之后实施后续实验步骤。

大鼠心肌组织miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平的检测使用实时荧光定量PCR方法；NLRP3、caspase-1蛋白表达水平检测采取Western blot检测；使用ELISA试剂盒检测IL-18、IL-10、IL-6、IL-1β浓度。

1.3 统计学处理

对于研究中观察和测量的数据适应均数±标准差的方法进行表达，并使用SPSS18.0统计软件进行处理，数据资料使用t进行检验，当P<0.05时，表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血钙和血脂水平对比

研究组的TC、TG、LDLC和Ca2+水平均明显高于对照组(P<0.05)。如表1。

表1 大鼠血钙和血脂水平对比

2.2 心肌组织miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平及心肌组织NLRP3、caspase-1蛋白表达水平对比

研究组(AS大鼠)的miR-22水平明显低于对照组(正常大鼠)，NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平以及NLRP3、caspase-1蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。如下图1、图2。

2.3 各组的miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平及NLRP3、caspase-1蛋白表达水平对比

miR-22mimic组的miR-22明显高于空白组，NLRP3、caspase-1 mRNA表达显著低于空白组(P<0.05)，miR-22 inhibitor组和空白组的对比结果与之相反(P<0.05)；miR-22mimic组的NLRP3、caspase-1蛋白表达均明显低于空白组(P<0.05)，miR-22 inhibitor组明显高于空白组(P<0.05)。如下图3、图4。

2.4 各组的炎症因子表达水平对比

miR-22mimic组的IL-1β、IL-6和IL-18水平明显低于空白组和阴性组，IL-10明显高于空白组与阴性组(P<0.05)，miR-22 inhibitor组与空白组及阴性组的炎症因子水平对比结果与之相反(P<0.05)。如下表2。

图1 心肌组织miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平

图2 心肌组织NLRP3、caspase-1蛋白表达水平

图3 各组的miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平对比

与空白对照组比较：*P<0.05;与miR-22 mimic组比较：#P<0.05

图4 各组的NLRP3、caspase-1蛋白表达水平对比

1.空白对照组；2.阴性对照组；3.miR-22 mimic组；4.miR-22 inhibitor组；5.miR-22 inhibitor+siNLRP3组。与空白对照组比较：*P<0.05;与miR-22 mimic组比较，#P<0.05

3 讨论

冠心病是全世界范围内死亡病例及入院治疗的一个主要原因，此次研究结果表明：miR-22靶向NLRP3基因对冠心病大鼠内皮细胞炎症损伤具有显著的影响，对于细胞凋亡以及炎症因子的表达具有明显的调节保护作用[5-8]。相较于正常大鼠，冠心病大鼠的血钙、血脂以及miR-22水平、NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平和NLRP3、caspase-1蛋白表达水平均发生显著变化。NLRP3炎性体属于当下结构与功能最明确的一种炎性体，能够在动物动脉粥样硬化斑块中激活，且在冠心病患者主动脉中过表达显著。NLRP3属于miR-22的靶向基因，转染miR-22过表达物后，NLRP3、caspase-1表达水平明显下降，转染miR-22抑制物后则显著上升，提示miR-22靶向NLRP3抑制，能够使冠心病大鼠心肌血管内皮细胞凋亡得到有效缓解[9-11]。NLRP3炎症小体激活后，能够促进caspase-1活化，促进pro-IL-1β和pro-IL-18成熟及分泌[12,13]。动脉硬化时，磷酸钙结晶体能够激活caspase-1，巨噬细胞释放炎症因子，从而导致动脉粥样硬化斑块的形成，这与此次研究的结果具有一致性[14,15]。因此，miR-22靶向NLRP3能够使相关炎症因子的水平得到控制，减缓内皮细胞炎症损伤。综上所述，miR-22能够利用显著的NLRP3基因靶向抑制效果，改善冠心病大鼠的内皮细胞凋亡状况，且能够促进炎症因子水平的下降，具有显著的内皮细胞保护作用。