山楂叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Caspase-3表达的影响

曲若宁，李丽静，吴晓光

(1.吉林大学中日联谊医院 药学部，吉林 长春130033;2.承德医学院附属医院 药学部;3.河北省中药开发与研究重点实验室)

脑缺血再灌注损伤是多种机制参与的复杂病理过程，而脑组织持续性缺血缺氧诱发神经元凋亡，为梗死灶扩大和迟发型神经元损伤的主要机制[1，2]，凋亡决定了最终梗死体积[3]。因此，研制抑制细胞凋亡的药物，可有效减轻缺血性脑损伤的程度[4]。山楂叶总黄酮(TFHL)是中药山楂叶中黄酮类化合物的总称，具有抗自由基、抑制炎症反应过程等药理作用，目前临床广泛应用于心血管疾病[5]。本研究以线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型，观察TFHL对脑缺血再灌注损伤的作用及其对凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响，旨在从细胞凋亡角度探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠90只，(8-9)月龄，体质量230-250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证书：scxk(京)2006-2009。

1.2 动物模型建立参照Longa[6]法并加以改进，采用线栓法建立左侧大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型。线栓采用0.235 mm钓鱼线，自颈外动脉插入颈内动脉直至大脑中动脉起始部，插入深度距颈动脉分叉约18.5±1 mm，2 h后拔除线栓实现再灌注。假手术组5只，除不插入线栓外其他操作同模型组。大鼠清醒后，参照Bederson[7]等方法，对MCAO大鼠进行神经功能评分：0分，无任何神经损伤症状；1分，提尾时右前肢屈曲；2分，爬行时向右侧转圈；3分，自发运动时向右侧转圈，成追尾状或向右侧倾斜；4分，不能自然行走或意识完全丧失。选取1-3分者入实验，选出有效模型75只，随机分为模型组、TFHL低、中、高剂量组和阳性对照组，每组15只。

1.3 给药剂量与方法以TFHL为治疗药物，银杏叶片为阳性对照药物，灌胃给药，连续36 d。TFHL低、中、高剂量组给药剂量为70、140、280 mg·kg-1·d-1，银杏叶片给药剂量为24 mg·kg-1·d-1。假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

1.4 检测指标

1.4.1TTC染色 末次给药后1 h，每组随机取6只，断头取脑，-20℃冰箱冻存3 min，蜡板上行冠状切片，片厚2 mm，共切5片。将脑片置于2%TTC中染色，37℃恒温孵育60 min。数码相机拍照，应用MiVnt病理图形分析系统测量脑梗死面积和全脑面积并计算脑梗死体积占大脑总体积的百分比。

1.4.2电镜观察海马CA1区神经元超微结构的改变 末次给药后1 h，每组随机取3只，30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液左心室插管灌注固定后，体式显微镜下选取缺血边缘区1 mm3大小脑皮质，3.5%戊二醛后固定，用于超微结构观察。

1.4.3脑组织切片病理学检查 末次给药后1 h，每组随机取6只，30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定后，断头取脑，在蜡板上选取脑组织视交叉至大脑横裂冠状脑组织，依次脱水、透明、浸蜡及包埋，Leica石蜡切片机连续冠状切片，片厚5 μm，4℃冰箱保存,备用。常规HE染色、封片，光镜下观察并拍照。

1.4.4免疫组化检测 兔抗Caspase-3单克隆抗体购于美国santa公司，SP免疫组化试剂盒购于北京中衫金桥生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。取上述4℃冰箱保存备用的大脑切片，常规脱蜡脱水，按试剂盒说明书操作步骤操作，DAB显色，光镜下Caspase-3阳性染色呈棕黄色。阴性对照片用PBS代替一抗，其余操作相同。拍照，再Mivnt显微图像分析系统下进行半定量分析。对采集图片中的棕黄色颗粒进行密度扫描，测平均灰度值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 山楂叶总黄酮对MCAO大鼠脑梗死体积的影响

假手术组大鼠脑片呈均匀的红色，未见梗死灶，其他各组缺血侧皮质、纹状体、苍白球部分区域呈现不同程度的梗死区(图1)。但与模型组比较，TFHL各组脑梗死体积明显减少(表1)。

a:假手术组；b:模型组;c:L-TFHL;d:M-TFHL;e:H-TFHL;f:银杏叶片

图1 MCAO大鼠缺血区脑梗死体积(TTC 染色 )

2.2 山楂叶总黄酮对海马CA1区神经元超微结构的影响

电镜显示假手术组海马CA1区神经元染色质均匀，各种细胞器如线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体等结构界限清晰；模型组神经元肿胀，各种膜结构溶解、断裂、不连续，染色质凝集、边集，线粒体或出现嵴断裂、空泡化或致密，嵴分辨不清，其它细胞器明显减少；TFHL各组神经元超微结构损伤减轻(图2)。

2.3 山楂叶总黄酮对MACO大鼠海马CA1区神经元形态、密度的影响

由图3可见，假手术组海马CA1区神经元排列整齐紧密，可见3-4层细胞，染色均匀，结构完整，细胞核大而圆，核仁清晰；模型组大部分神经元变性坏死，正常神经元数量明显减少，排列紊乱，细胞周围间隙加大，细胞核浓缩、深染、溶解或消失，胞质结构不清；TFHL各组神经元损伤明显减轻，正常神经元数量明显增多，排列稍规则，但仍可见部分神经元变性，核仁不清，核固缩或消失。

模型组的正常神经元密度(ND)计数明显降低，与假手术组比较，具有极显著差异(P<0.01)，提示缺血再灌注造成了海马CA1区神经元丢失；与模型组比较，TFHL各组神经元密度有所升高，且呈剂量依赖性(表2)。

2.4 山楂叶总黄酮对MCAO大鼠缺血区Caspase-3表达的影响

免疫组化法检测Caspase-3阳性染色光镜下呈棕黄色，阳性区域在神经元细胞核及细胞质。假手术组海马神经元中仅少量表达，棕黄色染色较浅；模型组海马神经元胞核出现大量棕黄色颗粒，染色较深，为强阳性；TFHL70、140和280 mg·kg-1·d-1组36d Caspase-3蛋白阳性表达细胞数量明显减少。见图4。

a:假手术组；b:模型组;c:L-TFHL组;d:M-TFHL组;e:H-TFHL组;f:银杏叶片

图3 TFHL对MCAO大鼠海马CA1区神经元形态的影响(HE染色400×)

注：与假手术组比较：*P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01

山楂叶总黄酮对Caspase-3 平均光密度比值的影响。与假手术组比较，模型组大鼠海马Caspase-3 蛋白表达的光密度比值显著升高(P<0.01)；与模型组比较，TFHL70、140和280 mg·kg-1·d-1三组36 d光密度比值分别降低，说明TFHL能显著抑制海马CA1区神经元Caspase-3蛋白的表达。见表2。

3 讨论

海马和皮层是公认的缺血易损区，而海马CA1区又是海马各段缺血损伤最敏感的区域，故本研究的主要观察对象为海马CA1区神经细胞和皮层。结果表明，TFHL能明显减少MCAO大鼠脑梗死体积，减轻海马CA1区神经元损伤，证明TFHL对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，这与其他学者研究结果相一致[8]。另外，本研究发现TFHL对脑缺血再灌注损伤的改善作用与剂量呈正相关，剂量越大，这种改善作用越明显，且TFHL280 mg·kg-1·d-1组36 d在减少脑梗死体积，减轻神经元损伤和抑制caspase-3等方面与银杏叶片24 mg·kg-1·d-1组36 d比较无显著差异性，这为TFHL药用开发提供了新的依据，虽然达到同样治疗效果的前提下，TFHL用量要大得多，但TFHL资源丰富，弥补了银杏叶资源不足的现状。

a:假手术组；b:模型组;c:L-TFHL;d:M-TFHL;e:H-TFHL;f:银杏片

Caspase-3是细胞凋亡级联信号通路下游关键的执行蛋白酶[9，10]，在神经发育乃至脑缺血等神经系统疾病的病理生理过程中发挥着重要作用[11],脑缺血性损伤可激活Caspase-3蛋白，启动细胞凋亡[12]，药物干预可抑制细胞凋亡[13]。本研究结果显示，TFHL各组Caspase-3表达较模型组显著减少，凋亡神经元数量减少。脑缺血再灌注模型组核膜溶解或断裂、染色质浓集，线粒体嵴断裂、空泡化嵴分辨不清，符合细胞凋亡过程中重要的细胞形态学改特征[14]，提示TFHL可能通过抑制Caspase-3介导的细胞凋亡途径达到对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。本研究从细胞凋亡角度探讨了山楂叶总黄酮和脑缺血再灌注损伤的关系，研究结果为研究防治缺血性脑血管病药物提供了依据。