电感耦合等离子体原子发射光谱法测定骨软骨一体支架中钙元素含量不确定度分析*

孙小莉 汤晓阳 王冬梅 吴 建 刘 东 刘向辉

因创伤、炎症、退变、肿瘤切除等疾病引起的关节软骨病变或骨软骨联合病变是骨科常见的疾病[1].关节软骨是一种无血管组织,软骨细胞主要依靠关节滑液及细胞周围基质以无氧酵解供给营养,其自身修复能力有限,如何促进关节软骨自身修复,并重建关节功能是临床难题之一[2].随着软骨组织工程学的发展,制备可降解、无毒性的生物支架材料,并接种种子细胞制备组织工程软骨来修复软骨缺损,是一种创伤小、不良反应少且简便实用的修复方法[3-4].

目前,利用组织工程技术体外构建工程化软骨修复、软骨缺损的支架产品已经批准可用于临床,其中包括壳聚糖支架[5-6]、胶原膜支架[7-9]、透明质酸支架[10-11]以及PVA支架等[12-13].组织工程软骨修复软骨缺损取得了巨大的进展,但仍然存在难以固定以及与周围宿主软骨或骨整合不良的问题[14].骨软骨一体支架中钙的含量间接地反映了骨软骨一体支架的力学性能,影响支架的修复性能和使用寿命,因此对骨软骨一体支架中钙元素的含量进行测定很有必要.为此,本研究通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)测定骨软骨一体支架中钙元素的含量,并根据国家计量技术规范《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1-2012)[15]的要求进行不确定度分析,为评定检测结果的可靠程度提供参考.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Optima 7000DV型电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)(美国PerkinElmer公司);XP205DR型分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);CEM MARS6型微波消解仪(美国Pynnco公司);EG-20B型全防腐电热板(广州基创仪器有限公司);Ca标准溶液10 mg/L(国家标准物质研究院);UP级浓HNO3(苏州晶瑞化学有限公司);UP级浓氢氟酸(苏州晶瑞化学有限公司);UP级浓高氯酸(苏州晶瑞化学有限公司);Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)作为实验用水.

1.2 试验方法

以兔脱细胞松质骨为骨软骨层组织工程一体支架的硬骨层,以兔软骨细胞外基质复合丝素蛋白为软骨层,采用冷冻-干燥法制备的一体支架,由天然骨软骨脱细胞材料和与天然生物材料相似的生物材料制成,生物相容性好,可作为修复关节软骨病变或骨软骨联合病变的医用材料.

1.2.1 样品检验液制备

精密称取约0.2 g(精确至0.0001 g)样品,于聚四氟乙烯消解罐中,分别加入硝酸(HNO3)4 ml,氢氟酸(HF)2 ml,置于电热板上120 ℃预消解30 min后冷却至室温25 ℃,将消解罐转移至微波消解仪中进行消解.微波消解程序设定5 min内温度达到200 ℃,保持10 min,然后10 min冷却至室温25 ℃,然后将消解液转移至50 ml容量瓶中用超纯水定容至刻度,摇匀,待测.

1.2.2 标准溶液制备

依次在6个100 ml容量瓶中加入0.0 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml钙标准溶液(1000 mg/L),用超纯水对其进行稀释并定容,摇匀,待测.

1.2.3 仪器参数

实验用仪器为Optima 7000DV型ICP-OES.工作条件参数:入射功率为1.5 kW, 氩气流量15 L/min,载气流量0.25 L/min,辅助气0.20 L/min,雾化器流量0.8 ml/min,冲洗时间为1 min,等离子炬点火60 min后进行试验.于仪器自动进样器上放置标样和样品,选取干扰较少的422.673 nm分析波长进行测定.

1.2.4 数学模型的建立

钙含量的计算为公式1:

式中X为试样中钙含量(mg/g);C为从标准曲线得到钙的质量浓度(mg/L);v为样品定容体积(ml);m为样品取样量(g).

钙检测是采用标准曲线法,试样测定结果的不确定度除浓度(C)、体积(V)及质量(m)外, 标准曲线、回收率及试样测量重复性都对测定结果产生影响,则公式1可转化为公式2:

式中R为回收率,f重为重复性修正因子,f校为校正曲线拟合修正因子.

2 不确定度结果与分析

2.1 不确定度来源分析

从测量过程和数学模型分析, 试样测定的相对标准不确定度主要由标准溶液配制引入的不确定度urel(C)、试样称量引入的不确定度urel(m)、试样定容引入的不确定度urel(v)、最小二乘法拟合标准曲线引入的不确定度urel(C0)、重复条件下测量引入的不确定度urel()以及仪器引入的不确定度urel()等方面引入[16].

2.2 各分量相对标准不确定度的评定

2.2.1 标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel(C)

(1)标准品引入的不确定度urel(C1).使用的标准溶液来自国家标准物质研究院,证书中给出的钙浓度为1000 mg/L,相对不确定度为:urel(C1)=0.5%.

(2)标准溶液稀释引入的不确定度urel(C2).用超纯水将标准溶液稀释成浓度为0.0、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L和20 mg/L的标准工作液.配制标准系列工作液所用的量具见表1.经过查看检定证书,得所采用100 μl、1 ml和5 ml移液枪给定的允差分别为±0.005 ml、±0.01 ml和±0.03 ml.如果按均匀分布进行分析,则标准溶液配制过程产生的标准不确定度和相对标准不确定度分别如下:

配制标准工作液时移液器的相对不确定度见表1.

表1 标准系列配制过程中移液器校准引起的不确定度

根据表1中的数据合成配制标准工作液时移液器的相对标准不确定度:

配制系列标准工作液使用了6个100 ml容量瓶,以单个100 ml容量瓶为例,20 ℃时,(A级)100 ml容量瓶的容量允差[17]为±0.1 ml,依据三角分布考虑,则100 ml容量瓶引入的标准不确定度为:

依据公式对其相对标准不确定度进行分析:

标准工作液所采用的溶剂为超纯水配制而成,20 ℃时玻璃的体积膨胀系数为2.5X10-5/℃[17];水的体积膨胀系数为2.1X10-4/℃[18].假定标准稀释时所采用的100 ml容量瓶的使用温度与室温一致, 则使用温度(实验时室温为23.5 ℃)引起的体积不确定度值为:

按三角分布考虑, 此实验温度下所产生的标准不确定度为:

依据公式对其相对标准不确定度进行计算后为:

合成标准工作液稀释过程的相对标准不确定度为:

合成标准溶液配制的相对标准不确定度为:

2.2.2 试样称量引入的相对标准不确定度urel(m)

待测试样同样使用十万分之一天平进行称量, 根据电子天平检定证书, 在d=0.1 mg、0≤m≤50 g条件下, 其最大允许误差为±0.5 mg, 按矩形分布考虑,其标准不确定度为:

称取试样0.2003 g,其相对标准不确定度为:

2.2.3 试样制备过程中的定容操作引入的相对标准不确定度urel(v)

使用100~5000 μl移液器移取1.2 ml超纯水定容至50 ml,查检定证书,得到给定的允差为±0.03 ml.按均匀分布处理,则其标准不确定度为:

则其相对标准不确定度为:

2.2.4 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C0)

将6个浓度的标准工作液分别上机检测6次, 测得的峰面积结果见表2.通过线性拟合,钙元素标准曲线在被测范围0~20 mg/L内回归方程和相关系数依次为:y=3841.8x-68.553,相关系数r=0.9999;标准曲线的残余标准偏差为217.42;标准曲线拟合数据见表2.

其中

应用该曲线进行测量时, 对被测试样检测10次,即p=10, 测得试样中钙的浓度见表3.

表2 标准曲线拟合数据

表3 试样液中钙浓度测量结果

表4 试样重复性测量结果

由表3计算得出试样中钙的平均浓度为12.34 mg/L,试样质量为0.2003 g,按公式(1)得到的试样中钙的最佳估计值为3.08 mg/g.

校准曲线拟合的标准不确定度为:

式中S为标准曲线的残余标准偏差, 数值为217.42;b为校准曲线的斜率数值为3841.8;p为试样测定次数,数值为10;n为校准溶液的测定次数,数值为30;Sxx为标准溶液浓度残差的平方和,数值为1446.67;为试样中钙的平均浓度, 数值为12.34 mg/L;为钙标准溶液的平均浓度, 数值为6.33 mg/L.

标准曲线拟合的相对标准不确定度为:

2.2.5 试样测量重复性引入的相对标准不确定度urel(R)

对12.34 mg/L浓度的试样进行标准添加后平行测定10次, 添加标准量为2.0 mg/L,所得结果见表4.

经计算,10次平行测定结果的平均回收率(R)为:

根据贝塞尔公式,单个测定值的标准偏差为:

试样测定平均值的A类标准不确定度为:

其相对标准不确定度为:

对平均回收率进行显著性检验[15-16].显著性检验采用t检验,当检验值t大于或等于临界值t(95,9)=2.26[15-16]时,则R于100%有显著性差异,表明必须考虑校准因子f重,用于修正结果,否则不采用.

实验中t值为:其值为小于临界值2.23,在计算公式中可忽略校准因子f重[15-16].试样测量重复性引入的相对标准不确定度为urel()=0.00605.

2.2.6 ICP-AES仪器引入的不确定度urel(Q)

实验使用的仪器为美国PerkinElmer公司Optima 7000DV型ICP-AES,标准不确定度为0.5%,取k=2.故由仪器ICP-AES引起的不确定度为(Q)=0.5%/2=0.0025.

2.3 合成标准不确定度的评定

根据各分量相对标准不确定度的评定[15-16]合成相对标准不确定度为:

试样中钙含量的合成标准不确定度为0.144 mg/g.

2.4 扩展不确定度的评定

扩展不确定度由合成标准不确定度乘以包含因子得到, 取置信水平95%,则k=2,骨软骨一体支架中钙含量的扩展不确定度为:

通过对骨软骨一体支架中钙含量的不确定度分析,当取样量为0.2003 g,取置信水平95%,k=2,测得骨软骨一体支架中钙含量为(3.08±0.288)mg/g.

3 结论

使用电感耦合等离子体原子发射光谱法对骨软骨一体支架中钙含量进行的测定,并通过对骨软骨一体支架中钙的不确定度的分析,得出主要不确定度来源为标准溶液配制、试样制备过程中的定容操作.为进一步提高数据的准确性,在检验检测过程中应提高标准品纯度以及使用精确的移液器.