芘对毛霉胞外聚合物质特性的影响

刘长风 李欣燕 贾春云

摘要：多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs）是由2个以上苯环连在一起的化合物，具有强烈的致癌、致畸、致突变作用，属于持久性有毒有害有机污染物。由于胞外聚合物（extracellular polymeric substances，简称EPS）的成分性质，EPS对PAHs有较高的降解效果。因而EPS在去除PAHs过程中的应用越来越受到重视。为研究芘对毛霉EPS产生的影响，分析比较不同浓度芘诱导后毛霉EPS的特征、生化成分和生物降解效果。用浓度梯度为0、10、20、40、80、120 mg/L的芘诱导毛霉，提取EPS进行表征及降解试验。结果表明，随着芘浓度的增加，毛霉EPS粉末表面松散程度增强，孔隙数量变多而且直径变大;EPS的蛋白质含量、多糖含量、类腐殖质含量均逐渐增长，并且当芘浓度达到80 mg/L时，这些值均达到峰值（EPS提取量为1 561 mg/L，糖类含量为1 042 mg/L，蛋白质含量为 562 mg/L，类腐殖质含量为312 mg/L）。当芘浓度为120 mg/L时，毛霉EPS粉末又重新变成板结状;EPS提取量和各种生化成分均减少，对芘的降解率也降低。与其他毛霉相比，以80 mg/L芘诱导后的毛霉EPS对芘有更强的生物降解能力。

关键词：毛霉胞外聚合物;目标污染物芘;生物降解;特性分析;污染土壤修复

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs）污染是世界各国所面临的重大环境与公共健康问题之一，其对土壤的污染问题尤为突出[1]。PAHs污染土壤的修复是当前国内外环境科学界的共同话题和主攻热点。与物理、化学修复法相比，生物修复技术具有非破坏性、经济性和安全性等优点，可广泛应用于中低浓度大面积PAHs污染土壤的修复，近年来在国内外引起广泛关注[2-3]。其中，微生物修复技术应用最广泛，主要是通过驯化土著微生物或人为投加外源微生物对土壤中PAHs进行转化、降解与去除[4]。微生物降解多环芳烃已成为最主要的多环芳烃污染土壤的修复技术。具有PAHs降解能力的细菌较多，如芽孢杆菌属（Bacillus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomohas）等[5]。真菌降解PAHs的效率通常高于细菌，在降解高环多环芳烃方面表现突出。研究表明，一些丝状真菌、担子菌、白腐菌和半知菌对四环或更高环数PAHs的降解具有一定的优势[6-7]。

PAHs污染土壤微生物修复过程中，胞外聚合物（extracellular polymeric substances，简称EPS）承接细胞壁及土壤表面PAHs，具有重要的桥联作用。EPS通过范德华力或乳化作用解吸土壤中的PAHs，增强PAHs的生物可利用性[8-10]。杨智临等研究发现，EPS与菌株联用处理石油污染土壤时，萘去除率达96%，菲去除率达100%[11]。EPS中的蛋白质和糖类，特别是蛋白质中色氨酸残基，对有機污染物的去除起重要作用。Pan等通过热力学计算得出活性污泥EPS与菲的作用是自发的、放热的，疏水相互作用是主要作用方式，且蛋白峰中的色氨酸参与其中[12]。Zhang等报道，一羟基芘（PAHs的代谢生物标记物）能与牛血清蛋白中的色氨酸残基发生键合作用[13]。此外，EPS中多糖结合态PAHs的生物利用率较高[14]。

可见，EPS中蛋白和糖类参与PAHs的降解过程，有关EPS的提取和表征方法已比较成熟。EPS的提取方法包括物理、化学提取法。物理提取法主要是利用物理手段增加胞外聚合物在溶液中的溶解度，从而达到提取EPS的目的。如热提取法、离心法、超声波提取法等。化学提取法是利用生物膜的内传质作用使试剂中的离子或分子进入生物膜并与胞外聚合物发生接触，胞外聚合物的大分子会转化成为水溶性成分进而被提取出来。NaOH提取法是比较常用的方法，此外还有乙二胺四乙酸提取法、硫酸提取法、阳离子交换树脂法、甲醛超声波法等[15-18]。化学提取法虽然产率高，但样品易被流出的胞内物质污染[19]。EPS的表征方法较多，EPS成分用色谱、质谱及其组合进行定性和定量分析[20];胞外聚合物的功能基团和元素组成用X-射线光电子能谱、红外光谱、三维荧光光谱、核磁共振等仪器解释[21-25];EPS形貌一般用扫描电子显微镜、透射电子显微镜来表征。

为了深入研究EPS在PAHs污染土壤修复中的作用，本试验以毛霉EPS为研究对象，以芘为目标污染物，通过室内模拟试验，联合多种检测技术，探索芘对毛霉EPS的特征影响。

1 材料与方法

1.1 试验用菌种及培养

试验用毛霉（Mucor mucedo）菌种由中国科学院沈阳应用生态研究所土壤污染生态组提供。斜面培养基（PDA）：马铃薯去皮后洗净，称取200 g切成小块，加1 L水煮沸20 min，滤去马铃薯块，冷却后加入20 g葡萄糖，定容至1 L，pH值自然，在1×105 Pa灭菌30 min。种子培养基：4.000%蔗糖，0.400%（NH4）2HPO4，0.100% KH2PO4，0.050% MgSO4·7H2O，0.005%维生素B1，pH值为6.5。在250 mL三角瓶中装入150 mL液体种子培养基，在1×105 Pa灭菌20 min，冷却后接入菌种，在摇床（温度为25 ℃，转速为120 r/min）中振荡培养。

1.2 毛霉EPS的提取方法

取40 mL生长到稳定期的菌体培养液，于2 000 r/min离心10 min，弃去上清液补充无菌水至原体积，于2 000 r/min离心3 min，弃去上清液补充无菌水至原体积，重复2次，去除液体培养基中的杂质，然后用加热法提取EPS。将上述菌悬液放入60 ℃的水浴锅中加热30 min，然后把样品在 8 000 r/min 离心10 min，上清液经过0.22 μm滤膜过滤后，得到的无色透明溶液即为EPS溶液，浓度用总有机碳（total organic carbon，简称TOC）来表示，TOC由mulit N/C3000 TOC测定仪测定。

1.3 毛霉对芘的降解试验

将真菌转接到液体培养基中，在30 ℃培养3 d。将单株菌株按10%的接种量接种到芘浓度分别为10、20、40、80、120 mg/L 的20 mL液体无机盐培养基（0.05% 酵母膏，0.50% NaCl，1.00% NH4NO3，0.50% K2HPO4，0.50% KH2PO4，0.02% MgSO4·7H2O，0.05%蔗糖）中，在30 ℃、130 r/min条件下振荡培养，取样分析培养基中芘的残留浓度。

1.4 芘浓度测定

芘的提取方法采用二氯甲烷萃取，首先将三角瓶中溶液过0.45 μm水相滤器，然后向滤后溶液中加入等体积的二氯甲烷，放入振荡器（温度为25 ℃，转速为180 r/min）中振荡 5 min，全部移入50 mL分液漏斗中，静置5 min，分层后将下层有机相存入烧杯，每个样品按此步骤重复萃取3次。将上述3次萃取液混匀，转移至烧杯中使用普通氮气吹至近干，最后用甲醇定容，过0.22 μm有机滤膜后移入液相色谱专用进样瓶中[26-27]。芘的浓度采用高效液相色谱法测定，仪器为Agilent-1200高效液相色谱仪。色谱仪主要设定参数：流动相为100%甲醇，流速为0.8 mL/min，可变波长检测器（variable wavelength detector，简称VWD）检测波长为254 nm，柱箱温度为35 ℃，进样量为10 μL。

1.5 EPS化学成分分析

糖类含量的测定采用硫酸-苯酚法[28]，蛋白质和腐殖酸的测定采用修正的Folin-Lowry法[29]，DNA的测定采用二苯胺法[30]。

1.6 EPS形态特征分析

EPS的形态特征采用环境扫描电子显微镜进行检测，将准备好的EPS样品冷冻干燥成粉末状，将制备好的EPS粉末粘在样品台上，镀金后照相检测。

1.7 EPS三维荧光光谱分析

提取的EPS样品可直接进行三维荧光测定。荧光光度计参数设定：发射扫描波长为0.25～0.65 μm，激发扫描波长为0.20～0.55 μm，激发和发射狭缝宽度为5×10-3 μm，扫描速度为12 μm/min，响应时间为自动方式，扫描光谱进行仪器自动校正。

1.8 EPS红外光谱分析

将提取到的EPS样品经真空干燥（-60 ℃，24 h），取适量的粉末用傅里叶红外光谱仪（型号：NICOLET380）进行测定，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次/min，测定范围为 4 000～500 cm-1。

2 结果与分析

2.1 毛霉EPS释放和芘降解的关系

由图1可知，随着污染物芘的浓度由0增加到 120 mg/L，毛霉EPS的含量呈先增大后减少的趋势。不加污染物芘时，提取的毛霉EPS含量为741 mg/L，10 mg/L芘诱导毛霉EPS的提取量增加到813 mg/L，随着芘浓度的增加，提取到的EPS含量也在持续增加，直到芘的浓度增加到 80 mg/L 时，EPS的提取量达到峰值，为1 561 mg/L，比原毛霉EPS的提取量增加了820 mg/L，而120 mg/L芘则明显抑制了EPS的提取量，使其降低到403 mg/L，这说明芘的浓度小于80 mg/L可以促进毛霉EPS的分泌，而过高浓度的芘则起到抑制作用。随着芘浓度由10 mg/L增加到80 mg/L时，TOC值逐渐上升;芘浓度为120 mg/L时，毛霉对多环芳烃的降解率明显下降，其对芘的降解率由80%下降到43.8%。这与Machín-Ramírez等的研究结论[31-33]一致。Machín-Ramírez等以黑曲霉、木霉霉菌、酿酒酵母菌、粘质沙雷氏菌、芽孢杆菌、假单胞菌属等降解苯并芘，最大降解率为65%（初始浓度为50 mg/L）[31];Zafra等使用绿色木霉H15、曲霉H7、黄曲霉等多种真菌和细菌联用降解芘，14 d后，芘的降解率为 48.18%[32];Jia等的研究表明，毛霉对芘（初始浓度为 37.9 mg/L）的最大降解率为86.5%[33]。这些数据证实了真菌和细菌对芘的生物降解能力。

2.2 芘对毛霉EPS生化成分的影响

2.2.1 不同芘浓度下毛霉EPS主要成分含量的变化 由图2可知，毛霉EPS的4种主要成分中糖类的含量最高，其次为蛋白质，再次为类腐殖质，最后为DNA（由于提取EPS过程中没有破坏细胞核，EPS中DNA含量极低），随着污染物芘的浓度由0增加到120 mg/L，提取毛霉EPS中的糖类、蛋白质、类腐殖质含量呈先增大后减小的规律，而DNA的含量基本不变，这可能是因为毛霉为真核微生物，真核微生物的DNA一般多数在细胞核内，加热法提取EPS为物理方法，对细胞破损较小，不会破坏细胞核结构，因此DNA含量基本保持不变。综合不同浓度芘诱导毛霉EPS提取量的试验结果进行分析，4种主要成分中除DNA外，随着芘浓度增加的变化规律与毛霉EPS提取量的变化规律相同。80 mg/L芘诱导下，EPS的提取量与糖类、蛋白质、类腐殖质的含量均出现峰值。说明微生物在芘的诱导下，细胞会分泌降解所需的酶和糖类，而高浓度的芘则会对细胞产生毒性，从而抑制了微生物的生长，进而抑制其EPS的分泌。

毛霉EPS主要成分為糖类和蛋白质，其次为类腐殖质等，这与李绍峰等的研究结论[34-35]一致。与污泥EPS的主要成分为多糖和蛋白质的研究结果[36]也相似。加入芘诱导后蛋白质和多糖含量发生变化，因此，污染物芘对EPS的成分产生影响。Yue等从污水处理厂中分离出脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）菌株，培养过程中加入Cu2+、Zn2+、Cd2+，分析结果表明重金属的存在增加了EPS表面官能团的浓度[37]。

2.2.2 芘对毛霉EPS红外光谱的影响 由图3可知，光谱图上均出现多个吸收峰，说明EPS中存在较多官能团。3 400～3 200 cm-1 处的谱峰可归属为细胞表面蛋白质N—H键的伸缩振动和碳水化合物中结合水的O—H键的伸缩振动。1 650～1 620 cm-1处的谱峰来自典型的细胞蛋白质酰胺Ⅰ带（C—O的伸展振动）和酰胺Ⅱ带（N—H的弯曲振动与C—N伸展振动的叠加）。1 380～1 330 cm-1处的谱峰是烷基C—H伸缩振动的吸收带。1 200～1 000 cm-1处的谱峰是C—O键伸展振动的吸收带，谱带强，主要是多糖C—O键的伸展振动吸收，称为多糖区。另外，指纹区（1 330～400 cm-1）出现多个吸收峰，是由于整个分子振动转动引起的，表明毛霉EPS中存在着含硫、磷基团。由光谱a与光谱b、c、d、e、f比较可知，由光谱a中 3 346 cm-1 处宽而大的蛋白峰在光谱b、c、d、e、f中分别为 3 345、3 278、3 255、3 282、3 355 cm-1，C—O键向低波数移动，C—O键键长缩短，发生了红移，且随着芘浓度由10 mg/L增加到80 mg/L，移动长度由1 cm-1增加到 364 cm-1，当芘浓度增加到120 mg/L时，C—O键向高波数移动，C—O键键长增长，发生了蓝移，说明在芘诱导毛霉时EPS中的蛋白质参加了反应，且随着芘浓度的增大毛霉EPS中蛋白质对毛霉降解芘的促进作用呈先增大后减小的趋势。光谱a中1 555 cm-1处谱峰为酰胺（OCN—H）Ⅰ带，是C=O键的伸缩振动，诱导前后从11 648 cm-1分别移动到1 626、1 635、1 632、1 632、1 621 cm-1，这说明毛霉降解芘时，毛霉EPS中主要是羟基和酰胺基起主要作用。光谱a中 1 038 cm-1 处峰在不同浓度芘诱导后的光谱b、c、d、e、f中分别移至1 042、1 069、1 042、1 031、1 072 cm-1，发生红移，说明在毛霉降解芘时，EPS中多糖上的—COO被消耗，减少了 —COO 的含量。说明，在毛霉降解芘的过程中，EPS的主要成分糖类促进了降解反应的进行，随着芘浓度的增大蛋白质的促进作用呈现先增大后减小的规律。

红外光谱分析结果中羟基、酯基是疏水基团，羟基、羧基、

醛基、氨基和磺酸基是亲水基团。众所周知，蛋白质和多糖影响微生物菌株EPS的物理化学性质、疏水性和絮凝性[38]。EPS和污染物之间的驱动力主要来自疏水相互作用、氢键或静电相互作用[39]。由于EPS中存在一些疏水区域，许多有机污染物如菲、苯、染料（如甲苯胺蓝）等都可以被EPS吸收[40-41]。因此，在芘生物降解过程中，芘诱导后微生物EPS对芘降解效果的影响比原微生物的EPS更有效。

2.2.3 芘对毛霉EPS三维荧光光谱的影响 在0.230/0.350 μm 的激发/发射波长（Ex/Em）处识别出第一主要荧光峰（峰1），而另一个主峰（峰2）位于Ex/Em=0.275/0.350 μm 处。根据Hudson的分类[42]，这2个峰位于Ⅰ（芳香族蛋白质）和Ⅱ（芳香族蛋白质）的区域。它们与衍生自其中的芳香族氨基酸如酪氨酸和色氨酸蛋白质的化合物相关。

由表1可知，污染物芘的浓度由10 mg/L增加到 80 mg/L，荧光强度逐渐增强，色氨酸和酪氨酸含量随之上升，说明芘对毛霉向胞外分泌蛋白都有一定的促进作用，其中芘的浓度为80 mg/L时，蛋白峰的荧光强度达到最大值，色氨酸和酪氨酸含量最高。当芘的浓度为120 mg/L时，蛋白峰的荧光强度达到最小值，色氨酸和酪氨酸含量最低。也就是说，120 mg/L芘抑制了毛霉向胞外分泌蛋白。因此，适量芘诱导后，毛霉EPS中色氨酸含量增加。芘的加入使得EPS的峰1和峰2的荧光强度发生变化，这直接影响了EPS在芘去除过程中的作用。值得注意的是，经0～80 mg/L芘诱导，毛霉EPS在 0.230/0.350 μm的激发/发射波长处的类蛋白1，荧光强度由86.45 a.u.上升至221.30 a.u.;在 0.275/0.350 μm 的激发/发射波长处的类蛋白2，荧光强度由202.10 a.u.上升至243.10 a.u.;芘的浓度超过80 mg/L后峰1荧光强度减至 31.65 a.u.，峰2荧光强度减至180.10 a.u.。

芳香族蛋白质物质和类腐殖质是提取的EPS样品中的2种主要物质，特别是蛋白质中色氨酸残基，对有机污染物的去除起重要作用。通过热力学计算得出，EPS对菲的降解是自发的、放热的，疏水相互作用是主要作用方式，且蛋白峰中的色氨酸参与其中[12]。Zhang等报道，一羟基芘（PAHs的代谢生物标记物）能与牛血清蛋白中的色氨酸残基发生键合作用[13]。

2.3 芘对EPS表征的影响

图4为不同浓度芘诱导下液体培养毛霉EPS粉末放大 5 000倍的扫描电镜照片，由图4-a可知，未经驯化的毛霉EPS呈板结块状，四周凸起部分呈锋利薄片状。随着芘的濃度由10 mg/L增加到80 mg/L，EPS粉末逐渐变得松散多孔，尤其是80 mg/L芘诱导下的毛霉EPS的照片呈毛绒状，空隙量多

而且大，而120 mg/L芘诱导下的毛霉EPS没粉末又重新变成板结状。说明芘诱导明显影响毛霉EPS的结构，芘诱导后EPS具有更大的接触面和吸附力，能更好地促进芘的生物降解。

3 讨论与结论

EPS是同时含有亲水和疏水部分的两亲性化合物。因此，EPS可显示可溶疏水底物的表面活性[43]。在相互作用的初始阶段会产生使EPS和芘共聚的吸引力，如疏水相互作用[44-46]。在我国的报告中，EPS和PAHs之间的相互作用是自发的和放热的，PAHs与EPS的结合主要由疏水相互作用[47]。一些研究报道引入化学物质，如合成表面活性剂、生物吸收剂、细菌聚合物等，可以增强PAHs从土壤表面的解吸[48-50]。Liu等认为，细菌产生的细胞外聚合物可以增强吸收菲的释放程度[8]。因此，可以推断EPS可以增强芘在土壤表面的释放，进而增强PAHs的生物降解效果。

此外，驯化后EPS形态和成分的变化对PAHs的生物降解也有影响。电镜下未经驯化的黑曲霉EPS呈不规则块状，颗粒大且结块，使用未经驯化的黑曲霉降解芘，降解率达 56.61%[51]，与驯化过的毛霉相比降解率略低（80 mg/L芘驯化降解率为80%），除去菌种自身降解能力外，未经驯化的菌种EPS较为平滑，与驯化过的毛霉EPS相比，EPS与PAHs的接触面积较小，因而降解能力略低。就成分而言，微生物分泌的胞外蛋白作为介质为微生物摄入外来物质，胞外多糖起到对物质的吸附和絮凝作用，腐殖酸与有机物产生吸附和配合作用，形成大分子络合物[52-53]。几种化合物相互配合使得EPS与生物体间发生离子架桥、静电中和等反应所表现出的黏结性，有利于对多环芳烃的溶解吸附，提高微生物对多环芳烃的去除能力[54]，本试验结果与其基本一致。鉴于EPS的生物降解作用以及驯化后EPS形态和成分的变化，可以推测驯化后毛霉EPS对芘有更强的生物降解效果。

毛霉是高效的芘降解菌株，芘浓度为80 mg/L时，芘诱导后毛霉产生的EPS量最大，为1 561 mg/L，其中糖类含量为 1 042 mg/L，蛋白质含量为562 mg/L，类腐殖质的含量为 312 mg/L。0～80 mg/L芘诱导后毛霉EPS荧光强度渐强，这说明色氨酸和类腐殖质的蛋白质样物质的量有所增加。因此，80 mg/L芘诱导后毛霉产生的EPS更能促进芘的生物降解效果。80 mg/L芘诱导后的毛霉EPS呈毛绒状，质地疏松，接触面更大，吸附力更强，可以更好地促进芘的生物降解。

参考文献：

[1]Barth J，Steidle D，Kuntz D，et al. Deposition，persistence and turnover of pollutants：first results from the EU project AquaTerra for selected river basins and aquifers[J]. Science of the Total Environment，2007，376（1/2/3）：40-50.

[2]Teng Y，Luo Y M，Ping L F，et al. Effects of soil amendment with different carbon sources and other factors on the bioremediation of an aged PAH-contaminated soil[J]. Biodegradation，2010，21（2）：167-178.

[3]Lors C，Damidot D，Ponge J F，et al. Comparison of a bioremediation process of PAHs in a PAH-contaminated soil at field and laboratory scales[J]. Environmental Pollution，2012，165：11-17.

[4]Janbandhu A，Fulekar M H. Biodegradation of phenanthrene using adapted microbial consortium isolated from petrochemical contaminated environment[J]. Journal of Hazardous Materials，2011，187（1/2/3）：333-340.

[5]鄒德勋，骆永明，滕 应，等. 多环芳烃长期污染土壤的微生物强化修复初步研究[J]. 土壤，2006，38（5）：652-656.

[6]Bumpus J A，Tien M，Wright P，et al. Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus[J]. Science，1985，228（4706）：1434-1436.

[7]Asgher M，Bhatti H N，Ashraf M，et al. Recent developments in biodegradatipn of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme systemt[J]. Biodegradation，2008，19：771-783.

[8]Liu A，Ahn I S，Mansfield C，et al. Phenanthrene desorption from soil in the presence of bacterial extracellular polymer：observations and model predictions of dynamic behavior[J]. Water Research，2001，35（3）：835-843.

[9]Jia C Y，Li P J，Li X J，et al. Degradation of pyrene in soils by extracellular polymeric substances （EPS） extracted from liquid cultures[J]. Process Biochemistry，2011，46（8）：1627-1631.

[10]姜春阳. 微生物胞外聚合物在多环芳烃降解酶释放过程中的作用[D]. 沈阳：沈阳理工大学，2015：3-4.

[11]杨智临，陈 海，白智勇，等. 生物共代谢法降解石油污染土壤中的萘、菲[J]. 油气田地面工程，2014（11）：48-49.

[12]Pan X L，Liu J，Zhang D Y. Binding of phenanthrene to extracellular polymeric substances（EPS）from aerobic activated sludge：a fluerescence study[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2010，80（1）：103-106.

[13]Zhang J，Chen W X，Zhang W，et al. Interaction of 1-hydroxypyrene with BSA using fluorescence anisotropy and synchronous fluorescence analysis methods[J]. Chemical Journal of Chinese Universities，2015，36（8）：1511-1516.

[14]Johnsen A R，Karlson U. Evaluation of bacterial strategies to promote the bioavailability of polycyclic aromatic hydrocarbons[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2004，63（4）：452-459.

[15]Jorand F，Zartarian F，Tomas F，et al. Chemical and structural （2D） linkage between bacteria within activated sludge flocs[J]. Water Research，1995，29（7）：1639-1647.

[16]Bura R，Cheung M，Liao B，et al. Composition of extracellular polymeric substances in the activated sludge floc matrix[J]. Water Science and Technology，1998，37（4/5）：325-333.

[17]Morgan J W，Forster C F，Evison L. A comparative study of the Nature of biopolymers extracted from anaerobic and activated sludge[J]. Water Research，1990，24（6）：743-750.

[18]Houghton J I，Stephenson T. Effect of influent organic content on digested sludge extracellular polymer content and dewaterability[J]. Water Research，2002，36（14）：3620-3628.

[19]Domínguez L，Rodríguez M，Prats D. Effect of different extraction methods on bound EPS from MBR sludges：Part II：influence of extraction methods over molecular weight distribution[J]. Desalination，2010，262（1/2/3）：106-109.

[20]Dignac M F，Urbain V，Rybacki D，et al. Chemical description of extracellular polymers：implication on activated sludge floc structure[J]. Water Science and Technology，1998，38（8/9）：45-53.

[21]Omoike A，Chorover J. Spectroscopic study of extracellular polymeric substances from Bacillus subtilis：aqueous chemistry and adsorption effects[J]. Biomacromolecules，2004，5（4）：1219-1230.

[22]Morales O，Santiago G B，Chan M J，et al. Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biolfilm bateria[J]. Applied Microbiology Biotechnology，2007，102（1）：254-264.

[23]Sheng G P，Yu H Q，Wang C M. FTIR-spectral analysis of two photosynthetic hydrhogen producing strains and their extracellular polymeric substances[J]. Applied Microbiology Biotechnology，2006，73（1）：204-210.

[24]Akay O，zer A T，Fox G A，et al. Behavior of sandy slopes remediated by EPS-block geofoam under seepage flow[J]. Geotextiles and Geomembranes，2013，37：81-98.

[25]Lattner D，Flemming H C，Mayer C. 13C-NMR study of the interaction of bacterial alginate with bivalent cations[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2003，33（1/2/3）：81-88.

[26]謝重阁. 环境中石油污染物的分析技术[M]. 北京：中国环境科学出版社，1987：31-33.

[27]宋玉芳，区自清，孙铁珩. 土壤、植物样品中多环芳烃（PAHs）分析方法研究[J]. 应用生态学报，1995，6（1）：92-96.

[28]Zhang Z，Xia S，Wang X，et al. A novel biosorbent for dye removal：extracellular polymeric substance （EPS） of Proteus mirabilis TJ-1[J]. Journal of Hazardous Materials，2009，163（1）：279-284.

[29]Frolund B，Palmgren R，Keiding K，et al. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin[J]. Water Research，1996，30（8）：1749-1758.

[30]Domingues A. Composition，fate，and transformation of extracellular polymers in wastewater and sludge treatment processes[D]. New York：Cornell University，2000.

[31]Machín-Ramírez C，Morales D，Martínez-Morales M，et al. Benzo[a]pyrene removal by axenic- and co-cultures of some bacterial and fungal strains[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2010，64（7）：538-544.

[32]Zafra G，Absalón A E，del Carmen-Cuevas M，et al. Isolation and selection of a highly tolerant microbial consortium with potential for PAH biodegradation from heavy crude oil-contaminated soils[J]. Water，Air，& Soil Pollution，2014，225：1826.

[33]Jia C Y，Li X J，Zhang L F，et al. Extracellular polymeric substances from a fungus than a bacterium are more effective in polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation[J]. Water，Air，& Soil Pollution，2017，228：195.

[34]李紹峰，崔崇威，黄君礼. 胞外聚合物EPS对MBR膜污染的影响[J]. 哈尔滨工业大学学报，2007，39（2）：266-269.

[35]龙腾锐，龙向宇，唐 然，等. 胞外聚合物对生物絮凝影响的研究[J]. 中国给水排水，2009，25（7）：30-34，40.

[36]田卫东. 三种方法提取活性污泥胞外聚合物的比较[J]. 节能技术，2009，154（2）：184-186.

[37]Yue Z B，Li Q，Li C C，et al. Component analysis and heavy metal adsorption ability of extracellular polymeric substances （EPS） from sulfate reducing bacteria[J]. Bioresource Technology，2015，194：399-402.

[38]Guo W S，Ngo H H，Li J X. A mini-review on membrane fouling[J]. Bioresource Technology，2012，122（5）：27-34.

[39]Xu J，Sheng G P，Ma Y，et al. Roles of extracellular polymeric substances （EPS） in the migration and removal of sulfamethazine in activated sludge system[J]. Water Research，2013，47（14）：5298-5306.

[40]Spath R，Flemming H C，Wuertz S. Sorption properties of biofilms[J]. Water Science and Technology，1998，37（4/5）：207-210.

[41]Sheng G P，Zhang M L，Yu H Q. Characterization of adsorption properties of extracellular polymeric substances （EPS） extracted from sludge[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，62（1）：83-90.

[42]Hudson N，Baker A，Ward D，et al. Can fluorescence spectrometry be used as a surrogate for the biochemical oxygen demand （BOD） test in water quality assessment？ An example from South West England[J]. Science of the Total Environment，2008，391（1）：149-158.

[43]Desai J D，Banat I M . Microbial production of surfactants and their commercial potential[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews Mmbr，1997，61（1）：47-64.

[44]Jorand F，Boue-Bigne F，Block J C，et al. Hydrophobic/hydrophilic properties of activated sludge exopolymeric substances[J]. Water Science and Technology，1998，37（4/5）：307-315.

[45]Esparza-Soto M，Westerhoff P. Biosorption of humic and fulvic acids to live activated sludge biomass[J]. Water Research，2003，37（10）：2301-2310.

[46]Hilliou L，Freitas F，Oliveira R，et al. Solution properties of an exopolysaccharide from a Pseudomonas strain obtained using glycerol as sole carbon source[J]. Carbohydrate Polymers，2009，78（3）：526-532.

[47]Zhou W J，Zhu L Z. Efficiency of surfactant-enhanced desorption for contaminated soils depending on the component characteristics of soil-surfactant- PAHs system[J]. Environmental Pollution，2007，147（1）：66-73.

[48]Nie M Q，Yin X H，Ren C Y，et al. Novel rhamnolipid biosurfactants produced by a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterium Pseudomonas aeruginosa strain NY3[J]. Biotechnology Advances，2010，28（5）：635-643.

[49]Lai C C，Huang Y C，Wei Y H，et al. Biosurfactant-enhanced removal of total petroleum hydrocarbons from contaminated soil[J]. Journal of Hazardous Materials，2009，167（1/2/3）：609-614.

[50]姜春陽，贾春云，张丽芳，等. 微生物胞外聚合物对土壤中芘降解效果的促进作用[J]. 江苏农业科学，2015，43（6）：303-306.

[51]Czaczyk K，Myszka K. Biosynthesis of extracellular polymeric substances （EPS） and its role in microbial biofilm formation[J]. Polish Journal of Environmental Studies，2007，16（6）：799-806.

[52]Seo Y，Lee W H，Sorial G，et al. The application of a mulch biofilm barrier for surfactant enhanced polycyclic aromatic hydrocarbon bioremediation[J]. Environmental Pollution，2009，157（1）：95-101.

[53]Zhou Z，Sun H，Zhang W. Desorption of polycyclic aromatic hydrocarbons from aged and unaged charcoals with and without modification of humic acids[J]. Environmental Pollution，2010，158（5）：1916-1921.

[54]Mayer C，Moritz R，Kirschner C，et al. The role of intermolecular interactions：studies on model systems for bacterial biofilms[J]. International Journal of Biological Macromolecules，1999，26（1）：3-16. 安佑志，黎郡英，张凤太. 古镇旅游地土地利用格局演变及其驱动力研究——以贵州省青岩古镇为例[J]. 江苏农业科学，2019，47（6）：273-279.