稀释液配方和稀释倍数对猪精子活力及运动参数的影响

吴井生 陈永霞

摘要：为研究稀释液配方和稀释倍数对猪精子活力及运动参数的影响，筛选了5个稀释液配方，设计了6个稀释倍数，采用CASA系统检测精子活力、活动率、运动速度及运动方式等参数指标，利用SPSS 19.0软件中GLM程序进行分析表明，5个配方精子活力（PR）或精子活动率（PR+NP）中，F2最高，F3次之，但两者间差异不显著，与其他3个配方比较差异极显著;精子速度方面，同样以F2最快，仍与F3差异不显著，与其他配方差异显著或极显著;精子运动形式参数方面，WOB指标中，5个配方间差异均不显著;其他指标，F2和F3较高。稀释倍数上，就PR、PR+NP而言，两者均随稀释倍数的增大而表现出先上升后下降的趋势。因此，稀释液配方中，经典的猪稀释液配方为最优，确定配方为：葡萄糖5.0 g、柠檬酸钠0.3 g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）;稀释倍数PR、PR+NP中，D0.5最优，但从经济效益来看，D1为最佳。

关键词：猪;人工授精;稀释液配方;稀释倍数;精子活力;CASA

随着猪人工授精技术广泛应用，生产中对猪精液的要求也越来越高。猪的副性腺发达，因此猪精液中副性腺分泌物浓度高，射精量大，可达200～300 mL，密度（1～2）×109个/mL。研究表明，猪精液采集后若不进行任何处理，精子活力会迅速下降，精子死亡率增加，导致母猪受胎率降低;在保证精子活力、有效精子数等前提下，对猪精液进行适当的稀释，一方面可以增加精液量，提高受配母猪头数，另一方面可以冲淡精液中副性腺分泌物，巩固原生质膜，并供给充分的营养物质，防止细菌孳生，延长精子保存时间。因此，在人工授精前对精液进行适当处理可以提高公猪的种用价值，保证母猪群的健康，提高母猪受胎率，增加畜牧生产经济效益[1]。

关于猪精液稀释液配方的报道很多，经典的稀释液配方成分主要有：葡萄糖、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）;许多研究者从营养物质或缓冲物质替代物等方面来研究最佳的公猪精液稀释液配方，常见的替代物有海藻糖[2]、蔗糖[3]、维生素C[4]、甘氨酸[5]等。评价配方优劣的主要指标有精子活力、顶体完整性、质膜完整性等[6]，但这些指标的评价方法往往缺乏准确性、精确性和实效性。而关于猪精液稀释倍数的报道不多，仅见于对母猪受胎率或产仔数的影响[8-9]，但并未分析其对精子活力等指标的影响，精子活力检测是精液品质检查中的一个重要指标，同时精液品质检查是精液采集后、输精前的一项重要工作。

本试验从前人研究报道中筛选出5个经典稀释液配方，设计了不同的稀释倍数，利用CASA系统对公猪精子活力、活动率和精子运动等参数指标进行检测，以期筛选出最佳的稀释液配方和稀释倍数。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验的种公猪均来自江苏农林职业技术学院种猪场，品种和数量分别为：长白猪（L）3头、大白猪（Y）3头、杜洛克猪（D）4头、巴克夏猪（B）2头、梅山猪（M）6头;均为成年种公猪（28～38月龄）。每头种公猪采精2次/周，固定采精时间和采精员。试验时间为2016年11月至2017年7月，试验地点为江苏农林职业技术学院种猪场实验室。

1.2 精液采集和指标测定

公猪精液的采集用手握法进行;在采精过程中，弃去前、后段精清，收集中段富含精子部分，用4层灭菌纱布过滤精液，采完精后或精液稀释后，吸取10 μL精液，放入2 μL观察池（标准计数板，8个观察池，池体积22 μL/個，池高 20 μm），置于负相差显微镜下观察、检测。

采用西班牙CASA系统进行精液质量分析，测定的主要精子运动指标如下：

精子活力指标有PR（前向运动精子）、NP（非前向运动精子）;精子运动速度指标有VCL（平均曲线运动速率）、VSL（平均直线运动速率）、VAP（平均路径速度）;精子运动方式指标有LIN（直线性）、STR（前向性）、WOB（摆动性）、ALH（侧摆幅度）、BCF（鞭打频率）。

检测时，要求精子总数≥500个。

1.3 稀释液配方和数据统计

1.3.1 配制稀释液 本试验中共采用5个配方，分别标记为F1、F2、F3、F4、F5，每个配方体系为100 mL;配方中药品，均购自Sigma公司，采用分析天平准确称取;药品称取后，加入ddH2O在磁力搅拌器下充分溶解;用100 mL容量瓶定容后，放入事先高压灭菌的玻璃瓶中，贴上标签，4 ℃保存3 d;稀释液使用前，升温至37 ℃，加入青霉素和链霉素，具体配方见表1。

采集所得精液室温下放置1～2 h，用所配稀释液按1 ∶ 1比例进行稀释，稀释后静置2 min，后置于显微镜下观察检测。

1.3.2 稀释倍数的确定 取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0份稀释液，稀释液配方采用表1中的F2，分别加入1份精液中，组成稀释倍数分别记为D0、D0.5、D1、D2、D3和D4;取1份稀释液，配方采用表1中的F3，加入1份精液中，组成稀释倍数记为D5。

1.3.3 数据统计 应用SPSS 19.0软件中GLM程序对各项数据进行方差分析，差异显著或极显著时采用LSD法或Tamhanes T2法进行多重比较，结果用“最小二乘均数±标准差（x±s）”表示，其线性模型如下：

2 结果与分析

2.1 稀释液配方对精子活力或活动率的影响

不同稀释液配方下精子活力或活动率的结果见表2。由表2可知，PR方面，F2的PR水平最高，为0.107 3±0.133 8，其次为F3，两者间差异不显著（P>0.05），但与F5、F1、F4间差异极显著（P<0.01）;5个配方PR水平的总体趋势为：F2>F3>F5>F1>F4。PR+NP方面，F2的水平最高，F2、F3间差异不显著（P>0.05），F5和F1间差异不显著（P>0.05），F4的 PR+NP水平最低，与其他各组间差异均极显著（P<0.01）。

2.2 稀释液配方对精子运动速度参数的影响

不同稀释液配方下精子运动速度参数结果见表3。由表3可知，就VCL而言，F2的速度最快，为（27.37±9.03） μm/s，其次是F3，两者间差异不显著;F4的速度最慢，仅为（18.61±4.03） μm/s，与其他各组相比，差异极显著（P<0.01）;就VSL而言，F2的速度最快，为（6.89±2.99） μm/s，大小顺序为：F2>F3>F5>F1>F4，F1和F4分别与其他各组相比，差异均达到极显著水平;就VAP而言，F2的速度最快，其次是F3，并与F5、F1或F4相比，差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。

2.3 稀释液配方对精子运动方式参数的影响

不同稀释液配方下精子运动方式参数结果见表4。由表4可知，LIN方面，F2最高，为（24.66±5.59）%，其次为F3和F5，三者间差异均不显著（P>0.05），与F1和F4间差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）;STR方面，F3最高，与F2和F5相比，差异均不显著（P>0.05），与F4和F1相比，差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）;WOB方面，5个配种组合间差异均不显著（P>0.05）。就ALH而言，F3的最大，为（2.28±0.59） μm，与F2和F5均差异不显著（P>0.05），F1、F2和F5三者间差异也都不显著（P>0.05）;就BCF而言，F2和 F3一样快，均為 4.17 Hz，与其他各组间差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。

2.4 稀释倍数对精子活力或活动率和运动参数的影响

不同稀释倍数下精子活力（PR）和运动速度参数结果见表5。由表5可知，就PR而言，D0～D4间，D0.5最高，为 0.348 3±0.196 5;以D0为对照组，与D0.5差异显著（P<0.05），与D1差异不显著（P>0.05），与D2～D4差异极显著（P<0.01）;D1和D5差异不显著（P>0.05）。就PR+NP而言，D0～D4间，D0.5最高，为0.772 7±0.237 2;以D0为对照组，与D0.5、D1差异不显著（P>0.05），与D2、D3间差异极显著（P<0.01），D1和D5比较，差异不显著（P>0.05）。VCL方面，D0～D4间，D0.5最大，为（46.37±20.51） μm/s，与D0相比，D0.5差异极显著（P<0.01），与D1～D3差异不显著（P>0.05），与D4差异极显著（P<0.01）;D1和D5比较，差异显著（P<0.05）。VSL方面，D0～D4间，D0.5最大，为（14.38±6.35） μm/s;D0与D0.5差异极显著（P<0.01），与D1差异显著（P<0.05），与D2～D4差异不显著（P>0.05）;D1和D5比较，差异不显著（P>0.05）。VAP方面，D0～D4间，D0.5最大，为（26.06±11.08） μm/s;D0与D0.5差异极显著（P<0.01），与D1～D3间差异不显著（P>0.05），与D4差异极显著（P<0.01），D1和D5间差异不显著（P>0.05）。

2.5 稀释倍数对精子运动方式的影响

不同稀释倍数下精子运动方式参数结果见表6。由表6可知，LIN方面，D0～D4中，D4最高，为33.90%±12.70%;以D0为对照组，与D0.5～D3差异不显著（P>0.05），与D4差异极显著（P<0.01）;D1和D5间差异不显著（P>0.05）。STR方面，D0～D4中，D4最高，为58.12%±12.36%;以D0为对照组，与D0.5和D1差异不显著（P>0.05），与D2和D3差异显著（P<0.05），与D4差异极显著（P<0.01）;D1和D5间差异不显著（P>0.05）。WOB方面，D0～D4中，D1最高，为 （56.64±7.76）%;D0与D0.5～D4间差异均不显著（P>0.05）;D1和D5间差异不显著（P>0.05）。就ALH而言，D0～D4中，D0.5最高，为（2.81±0.70） μm;D0与D0.5和D1差异不显著（P>0.05），与D2～D4差异极显著（P<0.01）;D1和D5间差异不显著（P>0.05）。就BCF而言，D0～D4中，D2最快，为（5.23±1.49） Hz;D0与D0.5～D2间差异极显著（P<0.01），与D3差异不显著（P>0.05），与D4差异显著（P<0.05）;D1和D5间差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

关于猪精液稀释液配方的报道很多，马红等用本试验中的F4作为冷冻基础液或稀释液研究了民猪精液冷冻技术[7]。程明等研究4种稀释液对不同品种公猪精子活力的影响，结果显示，用葡-柠-乙液（本试验中的F2）稀释的精液在保存后20 h和32 h观察到的精子活力平均数要显著高于葡萄糖液、葡-柠液和自制多成分稀释液，因此认为葡-柠-乙液比其他稀释液更适合猪精的稀释[10]。王占赫等研究了不同稀释液对公猪精液保存效果的影响，所用11个稀释液配方必选药品有葡萄糖和柠檬酸钠，其他药品有EDTA、碳酸氢钠和KCl，结果显示，1号和2号稀释液的精子有效存活时间和精子存活总时间是最优的，两者间差异不显著，1号稀释液配方为：葡萄糖3.72 g、柠檬酸钠0.60 g、EDTA 0.12 g、碳酸氢钠 0.12 g、KCL 0.08 g，2号稀释液配方为：葡萄糖2.4 g、柠檬酸钠1.0 g、EDTA 0.1 g、碳酸氢钠0.1 g，2个配方的体系均为100 mL[11]。陈晓畅等研究了关中黑猪精液常温保存情况，结果显示不同稀释液中，保存效果最好的是Ⅲ号稀释液，可保存5 d，活力为0.5，短时间内（≤2 d），Ⅰ号和Ⅲ号保存效果无明显差异;而Ⅰ号稀释液成本更低，更适合生产实践中的应用;Ⅲ号稀释液配方为：葡萄糖27.50 g、柠檬酸钠6.90 g、EDTA 2.35 g、碳酸氢钠1.00 g、柠檬酸2.90 g、Tris 5.65 g，Ⅰ号稀释液配方为：葡萄糖37.00 g、柠檬酸钠6.00 g、EDTA 1.25 g、碳酸氢钠1.25 g、Tris 0.75 g，2个配方的体系均为1 L[12]。许多研究报道中猪精液稀释液配方中主要药品有：葡萄糖、柠檬酸钠、EDTA-2Na[2]，在此基础加入其他药品，诸如谷氨酰胺（Gln）[6]、羧甲基纤维素钠（CMC）[13]、海藻糖[2]、黄芪多糖[14]、精浆[15]、维生素C[4]、红景天多糖[5]、蔗糖[3]、甘氨酸[5]等，以期筛选出最佳的精液稀释液配方。本试验5个配方中，就精子活力（PR）或精子活动率（PR+NP）而言，F2的最高，其次是F3，但两者间差异不显著，与其他3个配方比较差异极显著;精子速度方面，也是以F2最快，与F3差异不显著，与其他配方差异显著或极显著;精子运动形式参数方面，就WOB指标而言，5个配方间差异不显著，其他指标以F2和F3为高。

关于猪精液稀释倍数的报道不多，沈培敏研究了猪精液不同倍数稀释授精效果，结果显示，稀释6倍时，受胎率最高，为92%，窝均产仔数最多，为11头，随后为稀释倍数2、4、8、10倍，认为精液稀释倍数小，精子密度大，供给精子贮存过程中的养分偏少，而稀释倍数过大，则有效精子会降低，而且活力也会降低，影响母猪繁殖性能[8]。李鼎禄等研究猪精液稀释倍数对受胎率窝产仔数的影响，采用的稀释液为葡-柠-乙液（本试验中的F2，配方略有不同，葡萄糖 5.55 g、柠檬酸钠0.50 g、EDTA-2Na 0.10 g），分别稀释3、5、8倍，结果显示，采用的各品种公猪精液进行8倍稀释时，与常规的3倍稀释间，对情期受胎率、窝产仔数无影响[9]。关于精液稀释倍数在羊[16-17]和鸡[18-19]上也有报道。在南江黄羊上，郭洪杞认为精液有效存活时间、第1情期受胎率以稀释倍数15倍较高，分别为50 h、80%[16]。徐相亭等研究显示，精液稀释3、4、5倍解冻后精子活率分别为0.502、0.501、0.495（P>0.05），均高于稀释6、7、8倍的精子活率（P<0.01），表明波尔山羊冷冻精液稀释倍数以3～5倍为宜[17]。张晓华等研究了鸡精液稀释的影响因素，结果显示鸡精液在先冷藏后等温稀释，高倍稀释的鸡精子活力显著低于低倍稀释，而先等温稀释后冷藏，高倍和低倍稀释的鸡精子活力差异不显著[18]。本试验中，就PR和PR+NP而言，两者均随稀释倍数的增大而表现出先上升后下降的趋势，D0.5最大，这种现象在其他动物均未有所报道，其中原因值得探究;从不同稀释液相同稀释倍数条件下的结果来看，两者差异不显著，说明所选2个稀释液配方对精子的影响相当。

4 结论

本试验中，就稀释液配方而言，以经典的猪精液稀释液配方为最优，配方如下：葡萄糖5.0 g、柠檬酸钠0.3 g、EDTA-2Na;就稀释倍数而言，从PR和PR+NP方面，D0.5最优，但从经济效益来看，D1是最佳的。

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