中华鳖胚胎组织原代细胞培养技术的研究

曹铮 林锋 卢淑娟

摘要：基于当前市场上中华鳖商业化细胞缺乏，不利于开展其病害防控研究的现状，以中华鳖胚胎为对象，采用组织块原代培养技术，从孵育15～20 d的受精卵中获得适宜的胚胎组织，经抗生素、乙醇消毒，通过无菌条件下将组织块均匀分散贴壁在细胞瓶中，然后于30 ℃恒温培养箱中贴壁培养4 h后加入无血清M199培养基多次清洗，从而获得了中华鳖胚胎组织原代细胞;在此基础上分别对中华鳖胚胎细胞传代培养条件、冻存与复苏等进行系统性研究，初步确定中华鳖胚胎细胞培养温度为26 ℃，M199或L-15培养基，血清浓度为15%（体积分数），通常7 d传代1次;二甲亚砜冻存保藏后，细胞复苏生长状况正常。

关键词：中华鳖;胚胎;原代细胞;培养

中华鳖是一种名贵的、经济价值很高的水生动物。在动物分类上，中华鳖属脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科（Trionychidae）。鳖科现有7属23种，我国仅有2属3种，其中鳖属有2个种，即中华鳖（Chinese soft-shelled turtle，Pelodiscus sinensis）和山瑞鳖（Palea steindachneri），其中以中华鳖最为常见。20世纪60年代日本开始进行中华鳖的人工养殖，我国的台湾、泰国等地随日本之后开始发展中华鳖的人工养殖，中国大陆大约于上世纪70年代中后期开始进行中华鳖工厂化人工养殖。随着我国人民生活水平的日益提高，对鳖的市场需求稳步增长，中华鳖养殖从20世纪90年代初期至中期进入了高速发展期。养殖技术也由集约化程度较低的池塘养殖转化为集约化程度较高的室内控温温室养殖，养殖密度大大提高。然而，随着中华鳖规模化养殖的迅猛发展，品种退化、病害严重以及基础研究薄弱等问题逐步影响着中华鳖健康养殖的可持续发展，特别是中华鳖各种病害大规模暴发，养鳖业损失惨重[1]。中华鳖病害防治成为中华鳖养殖过程中的关键环节之一，它直接关系到养殖者的经济效益。

近些年來，在广大科研人员的努力下，中华鳖病害防控研究取得了一定成果，譬如张奇亚等首次从有典型症状、濒于死亡的患病鳖样品检测到呈球形、大小直径约为30 nm的病毒样粒子[2];1999年，Chen等从患“红脖子”病的中华鳖分离到了直径120～160 nm的鳖虹彩病毒[3];2001年，范红结等从患病的中华鳖中分离到雷氏普罗威登菌，可引起中华鳖的败血症，并造成肺脏、脾脏等内脏广泛形成干酪样结节[4];2002年，孙红祥等从从患穿孔病、腐皮病、溶血性腹水病等濒死鳖的肝、心血和腹水中分离到20株细菌[5];2007年，沈锦玉等从患白底板病的中华鳖分离到嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌[6];2008年，Li等从患白斑病的中华鳖中成功分离到淡紫拟青霉[7];2015年，刘莉等从患出血症的中华鳖中分离到了直径约100 nm的RNA病毒[8]。然而，由于缺少来源于中华鳖的细胞系，导致中华鳖生物学相关的基础研究相对滞后，加上养殖环境的复杂性、病原的多样性，导致无法对引起中华鳖发病的致病机制进行判定，进而也无法采取有效的措施来进行防治。因此，本研究采用组织原代培养技术，完成了中华鳖胚胎原代细胞培养，建立了可连续传代的细胞系，将为中华鳖细胞生物学及其病害防控研究等提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鳖卵 健康中华鳖卵（受精卵孵化期在15～25 d），来自浙江某中华鳖养殖场。

1.1.2 试剂与耗材 青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶（Typsin）、二甲基亚砜（DMSO），均购自Sigma公司;培养基M199、L-15、胎牛血清（defined fetal bovine serum，DFBS），均为Gibco公司产品;细胞培养瓶、移液管、过滤器、移液辅助器等，均购自Axgen公司。

1.1.3 仪器 倒置显微镜（Olympus），Ⅱ级生物安全柜（Esco），低速冷冻离心机（Sigma），二氧化碳培养箱（Thermol），恒温培养箱（Sanyo），液氮罐（MVE）。

1.2 试验方法

1.2.1 原代培养 胚胎的收集：选取已受精孵化15～25 d的受精卵，先将卵体表用70%～75%乙醇喷洒，然后用眼科剪剪破卵壳，用眼科弯头镊子将胚胎从卵黄中取出，移入1×PBS（pH值为7.4，500 U/mL青霉素，500 U/mL链霉素）中待用。

将分离出来的胚胎组织放在1×PBS（pH值为7.4，500 U/mL 青霉素，500 U/mL链霉素）中清洗2遍，然后置于70%～75%乙醇中浸泡10～15 s灭菌。重复1次“70%～75%乙醇浸泡”步骤。再将胚胎组织放入无血清的M199培养基中清洗2次，然后移到无血清的M199（含500 U/mL青霉素，500 U/mL链霉素）清洗2次。

组织块的处理：将清洗干净的组织块移入完全培养基中，M199为基础培养基加入100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，20%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰氨。用眼科弯头剪刀将组织块剪成约1 mm3的块状。再用完全培养基清洗1次。然后用一次性细菌接种针将剪小的组织块均匀地分散到细胞瓶壁上。

组织块的原代培养：组织块分散到细胞瓶上后，先将细胞瓶翻转使有组织块的这一面向上，完全培养基在下面先不跟组织块接触。3～4 h后将细胞瓶翻回来，让完全培养基浸没组织块，置于24～31 ℃恒温培养箱中培养。

原代细胞形态观察：利用100×和400×的相差显微镜进行细胞外形观察，以此确定细胞的生长状态。其中，胚胎细胞形状比较多，有圆形、多角形、纤维状，甚至还有心肌细胞的产生（细胞可以有节奏地收缩），肺组织和肾组织多呈成纤维细胞和上皮样细胞，以成纤维细胞居多。

1.2.2 细胞的传代培养 中华鳖胚胎原代细胞进行传代培养，首先对可能适宜的培养基（R1640、M199、L-15、MEME）进行筛选;针对传代细胞培养所用培养基中的血清浓度，选择体积分数20%、15%、10%等多种浓度梯度进行分析比较，分别在20、24、26、28、30 ℃等不同培养温度下培养，以保证传代培养的细胞能够迅速增殖。

1.2.3 细胞的冻存与复苏 配制含10%体积分数DMSO、15%胎牛血清的冻存用细胞培养基，挑选处于对数生长期的中华鳖可传代细胞，利用适量的胰蛋白酶使细胞脱落下来，随即将细胞与培养基转入冻存管中，然后2 000 r/min离心 2 min，去除培养基与胰蛋白酶，加入适量预先配制好的冻存用培养基，轻轻吹打混合均匀，显微镜观察计数后，调节冻存培养基量，以细胞浓度达到106个/mL为宜。将待冻存细胞先置于4 ℃ 2～3 h后，转入-20 ℃ 3～4 h，-80 ℃过夜，最后转入液氮罐中长期保存。

随机挑选置于液氮罐中冻存2个月以上的中华鳖胚胎细胞进行复苏，先置于37 ℃水浴锅中使其快速溶解，然后 2 000 r/min 离心5 min，去除上清，用新鲜培养基轻轻吹打混匀，然后转入细胞瓶置于培养箱培养。

2 结果与分析

2.1 细胞原代培养

挑选孵化19 d的中华鳖卵（图1），再乙醇消毒后轻轻剪开卵壳，可以观察到所挑选的受精卵明显处于发育阶段（图2）;将胚胎组织从卵壳中剥离出来置于PBS中漂洗干净后（图3），再将胚胎组织置于含有抗生素培养基中浸泡漂洗杀菌（图4）;处理好的胚胎组织转移到新的培养基中，利用眼科手术剪将胚胎组织剪碎至1 mm3大小（图5）;用无菌接种针将剪碎的组织转入细胞瓶（图6），让组织均匀分布以利于细胞生长（图7）;胚胎细胞在30 ℃条件下，一般在2 d以后就可以在组织块周围长出原代细胞，4 d左右能长到细胞瓶表面的50%～60%，图8为培养3 d时，胚胎细胞生长情况。

2.2 胚胎细胞的传代培养

不同温度、不同培养基、不同血清浓度的对比试验结果表明，中华鳖胚胎细胞的传代培养可以在M199或 L-15培养基中正常生长，在血清体积分数为15%的培养基中生长增殖较快，明显优于使用5%或10%体积分数血清的培养基;而在培养温度方面，试验结果显示细胞在20 ℃生长缓慢，24～26 ℃ 生长较快，30 ℃生长旺盛但细胞容易脱落，比较可见以26 ℃的培养温度最为适合细胞生长增殖。因此，中华鳖胚胎细胞的传代细胞适宜培养条件可以确定为：含15%体积分数血清的M199或L-15培养基，26 ℃恒温培养，7 d左右传代1次。

2.3 细胞的冻存与复苏

对比试验表明，采用逐级梯度降温法来保存细胞，细胞复苏后的存活率较高，比如将冻存2个月的中华鳖胚胎细胞从液氮中取出后进行快速复苏，在用M199培养基（含30%胎牛血清）进行培养8～10 h后，存活细胞基本贴壁;更换培养基，去除死细胞，利用含15%血清的培养基继续培养，一般在3 d左右，细胞单层基本铺满（图9）。

3 讨论与结论

虽然中华鳖细胞建系工作一直在持续，2001年李正秋等报道了中华鳖心脏组织细胞的建系过程和细胞的生物学特性[9]、2010年曾令兵等介绍了中华鳖5种组织细胞的离体培养情况[10]，但是迄今为止市场上并没有商业化的中华鳖细胞系。

由于中华鳖源的细胞系缺乏，导致目前对其免疫学、病害致病机制研究手段受到较大局限，特别是病毒性疾病方面，目前主要集中于利用超离后电镜观察、超薄组织切片、组织病理学等方法进行研究[11-12]，这导致一方面研究进展较慢，另一方面不利于病原免疫技术的开发，比如病毒灭活疫苗这种较为快捷的病毒免疫保护方式在缺少细胞的情况下，无法进行规划化研制，单纯靠中华鳖组织病样来源，成本既高，成品又少，不能有效地進行推广利用。虽然经过研究人员的长期筛选，已在10多种鱼类细胞中筛选出一些对鳖病毒敏感的细胞，比如鲤上皮乳状瘤细胞（EPC）、草鱼卵巢细胞（CO）、鳗鲡性腺细胞（EG）等，可以用于观察病毒侵染的部分属性，但由于病毒感染宿主时有种属特异性，导致其结果无法很好地说明病原的致病情况[13]。

因而，本研究通过中华鳖胚胎组织原代细胞培养试验，不仅建立了1种中华鳖组织的原代细胞培养方法，而且获得了可传代培养的中华鳖胚胎组织细胞，这将有利于进一步在细胞水平上开展中华鳖免疫学、病原致病机理制多层面的研究，促进中华鳖病毒疫苗的研制，从而能极大地促进中华鳖养殖业的长期可持续性发展。

参考文献：

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[5]孙红祥，舒妙安. 中华鳖几种常见疾病病原的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医学报，2002，22（2）：140-142.

[6]沈锦玉，潘晓艺，余旭平，等. 中华鳖白底板病病原的分析[J]. 中国水产科学，2007，14（5）：815-822.

[7]Li X L，Zhang C L，Fang W H，et al. White-spot disease of Chinese soft-shelled turtles （Trionyx sinens） caused by Paecilomyces lilacinus[J]. Journal of Zhejiang University-Science B，2008，9（7）：578-581.

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[9]李正秋，张奇亚. 中华鳖心组织成纤维细胞系的建立及特性[J]. 中国兽医学报，2001，21（6）：583-585.

[10]李晓莉，曾令兵，张 燕，等. 中华鳖5种组织细胞的离体培养实验[J]. 水生态学杂志，2010，3（2）：111-115.

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[13]张奇亚，李正秋. 中华鳖病毒（TSV）对鱼类细胞的感染试验[J]. 中国兽医学报，2000，20（1）：15-18.葛翠翠，李 昊，冯 帆，等. 柠条利用方式对宁夏育肥滩羊体外消化及发酵参数的影响[J]. 江苏农业科学，2019，47（6）：144-147.