高产和高生物活性的铁皮石斛液体培养体系研究

张杰 许风国

摘要：通过对野生铁皮石斛的定向诱导和逐步驯化，筛选适合液体悬浮生长的铁皮石斛原球茎，并对其ITS（内转录间隔区）和Rbcl进行分子鉴定。在此基础上，建立了适合铁皮石斛原球茎快速生长的液体培养体系，对蛋白、多糖、醇浸出物、金属含量等成分进行检测分析。结果发现，以1/2MS+2.0 mg/L KT（激动素）+0.5 mg/L NAA（萘乙酸）+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L马铃薯提取物为铁皮石斛原球茎液体培养基，经5周液体培养，采收原球茎（318.3±22.5） g/L（鲜质量），平均生长率为（9.7±0.59） g/（L·d）（鲜质量），单个最大鲜质量为23.7 g，多糖含量为（19.09±1.05）%，醇浸出物含量为（37.82±3.50）%，蛋白质含量为42.51%，其中精氨酸含量高达19.23 mg/g，铅、镉、砷、汞、铜等金属含量远低于最高限定标准。结果表明，采用该液体培养体系，可培育生产出高产和高生物活性的铁皮石斛。

关键词：铁皮石斛;原球茎;液体培养;ITS; Rbcl

铁皮石斛（Dendrobium candidum）是一种珍稀中草药，具有生津养胃、抗衰老、抗疲劳、降血糖、保肝护肝、抗肿瘤和增强免疫力等作用[1-4]。在自然环境条件下，野生铁皮石斛对生存环境要求苛刻，种子萌发需要共生菌等作用[5]，加上毫无节制过度采集，野生铁皮石斛已被列为濒危物种[6]。目前广泛采用传统方式种植铁皮石斛中草药，但这种种植培育方式不仅需占用大量土地，培育周期长达3年，农药残留和重金属污染普遍严重，不同种石斛混合种植时，易造成异花传粉和杂交变种，而且种植使用大量无机化肥，易造成环境污染和品质下降等问题。为解决铁皮石斛这种传统珍稀中草药种植所面临的问题，培育品质纯正、无污染、高生物产量和高生物活性的铁皮石斛，本研究利用植物组织培养技术，建立了一种新型液体培养体系，培育生产高质量和高生物活性铁皮石斛珍稀中草药，可直接转化到铁皮石斛中试进行大规模商业化培育生產。

1 材料与方法

1.1 铁皮石斛的定向诱导和液体培养体系

1.1.1 铁皮石斛愈伤组织诱导 试验于2015年在江苏省苏州市进行。以浙江雁荡山野生铁皮石斛茎段为外植体，消毒处理，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的固体琼脂培养基上进行愈伤组织细胞诱导，培养温度为 25 ℃，采用全光谱LED（发光二极管）灯，光—暗周期12 h—12 h，光照度1 800 lx。

1.1.2 铁皮石斛原球茎的诱导和液体悬浮驯化 以铁皮石斛愈伤组织细胞为材料，在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+2%蔗糖的固体琼脂培养基上定向诱导原球茎的产生。在1/2MS+2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭的固体琼脂培养基上，可实现原球茎的快速生长增殖。将铁皮石斛原球茎转接到1/2MS+2%蔗糖液体培养基中，逐步悬浮驯化，筛选适合液体悬浮生长的铁皮石斛原球茎新品系。培养环境条件均为25 ℃，采用全光谱LED灯，光—暗周期12 h—12 h，光照度1 800 lx。

1.1.3 铁皮石斛液体培养体系 将适合液体悬浮生长的铁皮石斛原球茎新品系培育在1/2MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L马铃薯提取物的液体培养基中，将盛有液体培养基的三角瓶灭菌，于100 r/min悬浮液体培养，室温25 ℃，光质5 ∶ 1 LED红蓝光，光照度 2 500 lx，光—暗周期12 h—12h，液体培养5周。

1.2 铁皮石斛分子鉴定和系统进化分析

采用NCBI BLAST在线软件对铁皮石斛ITS和rbcL序列进行比对分析，并从NCBI下载相关ITS和rbcL序列用于构建系统树。用MEGA 7.0构建邻接系统树，采用Clusta lW序列比对，系统树自检1 000次。

1.3 铁皮石斛营养成分检测和分析

1.3.1 多糖含量测定 铁皮石斛原球茎干品和铁皮枫斗粉碎过100目筛，100 ℃热水回流，浸提2 h，离心过滤，取上清。上清液直接采用二硝基水杨酸（DNS）法[9]测定总糖（C总糖）、还原糖（C还原糖）和多糖含量（C多糖）。

C多糖=C总糖-C还原糖。

（1）

以葡萄糖为标准品，制作测定标准曲线，为y=1.981x-0.092 5，r2=0.992。

1.3.2 醇浸出物含量测定 根据2015年版《中国药典》醇溶性浸出物测定方法[10]，采用热浸法测定铁皮石斛原球茎干品和铁皮枫斗的醇浸出物含量。

1.3.3 氨基酸营养成分测定 根据国家食品氨基酸测定方法[11]，采用OPA/FMOC（邻苯二醛/9-芴甲基氯甲酸甲酯）全自动柱前分析-AminoQuant氨基酸分析法测定铁皮石斛原球茎氨基酸成分组成。

1.3.4 金属元素含量测定 根据2010年版《中国药典》元素检测分析方法[12]，采用安捷伦电感耦合等离子体质谱仪（Agilent 7500ce ICP-MS）对铁皮石斛原球茎进行元素含量的检测分析。

1.4 数据统计和分析

采用Origin 8.0对试验数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛的定向诱导和悬浮驯化

以野生铁皮石斛茎段为材料，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的琼脂固体培养基中，经45 d诱导培养，产生黄绿色颗粒状愈伤组织（图1-A）。将愈伤组织转接到含有0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+2% 蔗糖的1/2MS固体培养基上，经40 d诱导，会形成 6～8 mm 铁皮石斛原球茎（PLB）。为实现原球茎在固体培养基上的快速生长，则可采用在1/2MS固体培养基中添加 2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭（图2-B）的方法进行快速增殖培养。