脚板薯的组织培养与快速繁殖研究

杜尚广

摘要：为建立一套完整的脚板薯离体快速繁殖体系，以脚板薯茎段为试验材料，研究脚板薯茎段表面灭菌、丛生芽诱导、无菌苗增殖及移栽等。结果表明，脚板薯茎段丛生芽诱导的最佳培养基为MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭 1.2 g/L，诱导率为93.6%;丛生芽增殖的最佳培养基为MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.6 g/L+蔗糖40 g/L，增殖倍数为4.61，组培苗炼苗成活率达70%以上。本研究建立了脚板薯的离体快速繁殖技术体系，研究结果可为脚板薯的工业化育苗提供技术参考。

关键词：脚板薯;快速繁殖;增殖;组织培养

脚板薯（Dioscorea batatas Decne）是薯蓣科薯蓣属一年生或多年生藤本植物，因其地下块茎呈不规则的扁块形，形如脚掌而得名[1]，薯块单块质量1～2 kg，颜色有紫红色、白色2种。脚板薯以其肉质紫红、块大味美，并具有健脾、养胃、补肝等功效而闻名[2]，现已广泛种植于广东省、广西壮族自治区、福建省、江西省、湖南省等地。由于脚板薯块茎中富含蛋白质、淀粉、维生素、矿物质、以及较多的皂苷等成分，目前已作为一种经济作物在全球范围内大面积种植[3-5]。脚板薯中所含皂苷具有降血脂、调节血压和辅助治疗癌症的作用，具有很高的营养价值和药用价值，是一种具有很大开发价值的药食同源产品[4-6]。

近年来，随着对脚板薯化学成分及药理作用的研究不断深入，以及人们对健康饮食要求的逐渐提高，脚板薯的需求量进一步增加[7-8]。传统的无性繁殖方式出苗早、生长快，但繁殖系数低，用种量较大;长期的无性繁殖导致品种严重退化，产量大幅降低，迫切需要对脚板薯栽培品种进行脱毒改良，建立快速繁殖体系。传统的种子繁殖方式易造成薯蓣科植物后代单株之间差异较大，难以稳定保持优良性状。组织培养快繁技术是以优良无性系为外植体，通过无菌培养快速得到组培苗;该技术具有产量高、易于生产管理且能保持原有品种的优良性状等优点，可以有效克服传统无性繁殖和种子繁殖存在的问题[9-10]。

目前，有关薯蓣科组织培养方面的研究国内外均有报道。Malaurie等对不同品种山药进行了增殖和生根培养[11]。Jasik等在培养基中添加茉莉酸对山药进行诱导[12]。Alizadeh等对菊叶薯蓣进行体外增殖，表明适量外源激素对薯蓣科组织培养有较大促进作用[13]。王应想等对脚板薯试管苗的生长、茎节产生和零余子诱导进行研究，但尚未建立离体快繁技术体系[14]。目前，对脚板薯离体快繁的研究尚未见报道，本研究采用脚板薯的茎段为外植体，通过对脚板薯茎段表面灭菌、不定芽诱导、无菌苗增殖及移栽等，增殖过程同步壮苗和生根，省时省力且移栽成活率很高，无需专门进行壮苗和生根培养;本研究建立了离体快速繁殖体系，以期为脚板薯工厂化育苗及脱毒苗的培育提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脚板薯块茎由江西省万载县辉明有机农业科技开发有限公司提供。琼脂、蔗糖等所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

ZY100型同时蒸馏萃取仪，上海银泽仪器设备有限公司生产; LMQC型立式灭菌锅，山东新华医疗器械股份有限公司生产;SW-CJ-2FD净化工作台，上海博迅实业有限公司生产;JY3002电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司生产;艾柯DZG-303A超纯水仪，成都唐氏康宁科技发展有限公司生产; RDX型智能人工气候箱，宁波东南仪器有限公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 外植体的表面灭菌 选择块茎大、无病虫害、肉质紫红色的脚板薯，将其切成小块，每块50～100 g，确保每小块块茎均带有芽眼;然后，将每小块的切面沾满草木灰，放在太阳下晒1～2 h，室内晾1～3 d;待切面愈合后再播种，可防止切口腐烂，促使发芽整齐。当芽长至2～3 cm时，取1 cm茎段，每个茎段含有1个节点，洗衣粉浸泡10 min，流水冲洗30～60 min，在无菌工作台上利用2步法脱毒，即75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，然后用0.1%氯化汞浸泡2～3 min，无菌水冲洗4～5次。将处理好的外植体接种到MS培养基中。

1.3.2 丛生芽诱导培养基的筛选 为获得最适丛生芽诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，选用L16（45）设计进行4因素4水平的正交试验，14 d后，统计丛生芽诱导率;根據设计在每种培养基中接种40个茎段，每种20瓶，每瓶2个。

丛生芽诱导率=诱导出丛生芽的外植体数÷接种的外植体数×100%。

1.3.3 丛生芽增殖培养基的优化 以MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.2 g/L+蔗糖40 g/L+琼脂7 g/L为诱导培养基，培养茎段20 d。选用MS培养基为基本培养基，添加1.6 g/L活性炭以防褐化，并选用L16（45）设计进行4因素4水平的正交试验。每种培养基中转接40个上述含有丛生芽的茎段，培养20 d，观察、统计每组的增殖倍数。

增殖倍数=丛生芽数÷接种的外植体数。

1.3.4 炼苗和移栽 将接种于丛生芽增殖培养基中的芽体培养60 d后，向组培瓶中加入丛生芽增殖的液体培养基，约1 cm 深，15 d之后进行室外炼苗。将组培瓶从组培室中移至室外阴凉处放置5～7 d，然后开盖保持5～7 d，在此过程中喷洒少量水，保持湿润环境。取出组培苗，用自来水洗净根部残留的培养基，再用0.1% KMnO4浸泡30 s，最后用自来水清洗，将处理好的组培苗移栽至土壤 ∶ 珍珠岩（1 ∶ 3）的混合基质中，组培苗长出3片新叶即计为成活，统计移栽成活率。

1.4 培养条件

组培室白天温度（25±2） ℃，夜间温度（20±2） ℃，光周期12 h/d，光照度3 000 lx。

2 结果与分析

2.1 丛生芽诱导培养

激素是诱导丛生芽分化的关键物质，对丛生芽的生长起到决定性的作用。接种5 d，脚板薯茎段节点处开始萌动，然后芽不断生长膨大，叶片逐渐由紫红色变成深红色;14 d后，丛生芽生长速度加快，设计正交试验探索不同激素组合对脚板薯丛生芽的影响（表1至表3）。

从表1可以看出，4个因素对脚板薯诱导的影响大小依次为活性炭>烯效唑>NAA>6-BA。分析结果表明，当NAA浓度为0.4 mg/L时，诱导率最高，较低浓度的NAA有助于芽的生长;当6-BA濃度为3.2 mg/L时，脚板薯的丛生芽诱导效果最好，原因是不同浓度的6-BA具有促进或抑制酶的活性，从而影响芽的生长;当活性炭浓度为1.2 g/L时，诱导出的腋芽数最多，长势最好，随着活性炭浓度的升高，脚板薯褐化情况显著改善，但腋芽数目降低、长势较差;可能是活性炭吸附脚板薯切口处的酚类物质，防止褐化的产生，同时也吸附培养基中丛生芽诱导所需的激素和营养物质，不利于诱导的进行;当烯效唑浓度为2.9 mg/L时，叶片浓绿、茎粗壮、长势最好，诱导率最高;随着烯效唑浓度的增大诱导率先增大后减小，可能是高浓度的烯效唑活性较强，抑制芽的生长。由极差分析可知，丛生芽诱导效果最佳的组合是A2B1C1D2，即：MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.2 g/L。在此条件下试验在正交表的16次试验中并没有出现，通过做补充试验，结果得到丛生芽诱导率为93.6%、芽数达2.05个，大于正交试验结果中的诱导率最高值（90.0%）、芽数（1.97个），说明利用正交试验优化丛生芽诱导是成功的。

2.2 丛生芽增殖培养

脚板薯组培苗在16种不同培养基上培养20 d后，对丛生芽的数量进行统计，结果见表4、表5。从表4可以看出，NAA、6-BA、烯效唑、蔗糖4个因素对脚板薯丛生芽增殖生长影响差异较大，不同因素影响大小依次为NAA>烯效唑>蔗糖>6-BA。随着NAA浓度增大，增殖倍数呈先增大后减小趋势，当NAA浓度为0.7 mg/L时增殖倍数最大;当6-BA浓度为0.8 mg/L时增殖倍数最高;随着蔗糖浓度的增加，增殖倍数先增大后减小，当蔗糖浓度达40 g/L时增殖倍数最高;烯效唑具有控制营养生长，抑制细胞伸长、缩短节间、矮化植株，促进侧芽生长的作用，当烯效唑浓度为3.1 mg/L时增殖倍数最大。本试验结果表明，不同培养基对丛生芽的增殖无显著影响，最佳增殖效果的培养基为：MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+蔗糖 40 g/L+活性炭1.6 g/L，增殖倍数为4.61。

在培养的过程中，当MS培养基中添加NAA 0.7 mg/L、活性炭1.6 g/L、烯效唑3.1 mg/L、6-BA 0.8 mg/L、蔗糖40 g/L 时，丛生芽生长快、繁殖系数高;叶色浓绿、茎段粗壮，所以无需专门进行壮苗培养;同时，茎段节点处萌动生根并形成发达的根系，有时根的生长速度高于茎的生长 （图1-B、图1-C），炼苗和移栽环节成活率较高，可满足生产的需要，所以无需再进行生根培养。即，丛生芽增殖过程中壮苗和生根同步进行，并取得很好的效果，所以，本试验无需专门进行壮苗和生根培养。这大大缩短快繁体系所用时间、降低培养成本，建立更为有效的脚板薯快繁体系（图1-D）。

2.3 炼苗和移栽

完整的再生植株炼苗之前（图1-B），在组培瓶中加1 cm 深的液体增殖培养基，组培苗生长更快、茎秆更加粗壮，对比发现，加液体培养基比不加液体培养基的组培苗平均高约1.5 cm;并且在炼苗过程中，组培瓶内部环境湿润，能够有效防止叶片枯萎，提高成活率。

处理后的组培苗（图1-C），剪掉失水的叶片，可有效防止叶片细菌孳生，污染致死。组培苗较为脆弱，叶片易失水，移栽置于阴凉通风的温室大棚中，可提高成活率。研究发现，炼苗成活率达70%以上。

3 结论

本试验得到了脚板薯茎段丛生芽诱导的最适培养基为MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.2 g/L，诱导率为936%;丛生芽增殖的最佳培养基为MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.6 g/L+蔗糖40 g/L，增殖倍数为4.61;增殖过程同步进行壮苗和生根，炼苗成活率可达70%以上。本研究建立了脚板薯脱毒快繁技术体系，为工厂化育苗提供技术支持。

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