软骨修复临床转化的挑战与机遇

史冬泉，李嘉威

0 引 言

软骨组织是人体内重要组织，主要分布在四肢关节、椎间盘、支气管和耳朵轮廓等处。软骨组织在四肢关节处主要成分为透明软骨，在负重、关节润滑和四肢运动中起着十分重要的作用［1］。关节软骨中80%的成分为水分，其余为细胞外基质和软骨细胞。其特点是缺乏血管、神经和淋巴的分布，因此关节软骨在损伤后难以修复并常常发展为骨关节炎［2］。目前对于软骨损伤修复包括保守治疗及手术治疗。保守治疗主要是通过药物缓解疼痛和炎症，包括选择性2型环氧酶（cyclooxygenase 2-selective，COX-2）抑制剂［3］、非甾体类抗炎药物（nonselective nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）及关节腔注射皮质类固醇类药物［4］。手术治疗包括微骨折、软骨同种异体移植、软骨自体移植［5］。这些方法虽然都取得一定的疗效，但是仍然存在许多的限制和不足。因此，需要更有效的方法和途径来促进软骨再生和整合，并为原始软骨提供持久的功能上的替代。目前软骨缺损治疗方法的局限性，促使软骨组织工程领域寻求将材料工程原理和生物学原理相结合，促进新软骨的生长以替代受损组织。在组织工程领域，一些天然和合成的支架材料已经被评估并进行研究。多数研究者试图模拟原始天然组织的某些特点（形状、机械性能、含水量等），然而，目前大多数在开发既能模拟原生组织的化学性质又能模拟其机械性质的材料，以及体现其生物功能的过程中所做的进度都是有限的，这也导致了其在临床转化上的困难。

1 软骨损伤的治疗现状

软骨损伤的传统治疗主要以外科为主，包括关节腔注射和外科手术治疗。关节腔注射是一种将特定药物注入到关节内部的微创手术。皮质类固醇是国际骨关节炎研究协会指南推荐的在关节内注射的抗炎剂，以减轻骨关节炎产生的疼痛［6］。然而，关节内注射皮质类固醇仅在低剂量时起作用，皮质类固醇的高剂量和长期暴露与软骨损伤和软骨细胞毒性相关［7］。透明质酸是膝关节正常滑液的重要组成部分，也是关节稳态的重要组成因素［8］。但是据随机临床试验的meta分析显示，与安慰剂治疗组相比，并未发现膝关节腔内注射透明质酸具有显著治疗效果［9］。

临床实践中广泛用于软骨修复的外科手段主要为微骨折和镶嵌成形术。微骨折主要是进行软骨下骨的破坏，以促进骨髓来源的多能基质细胞向软骨缺损区域募集，从而达到修复目的［10］。多项证据表明，微骨折仅对小缺损软骨损伤有效［11］。镶嵌成形术是用从关节软骨的非负重区采集的自体移植物替换软骨缺损区域［12］。但该项技术的结果和有效性受限于年龄、性别和病变大小［13］。随后，软骨修复组织技术开始在组织工程方向发展，先后经历了4代技术。第1代软骨组织工程技术即1994年报道的自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）［14］。ACI是采用从关节软骨的非负重区域采集的自体软骨细胞在体外培养扩增后，将这些细胞注射到软骨缺损区域中，并用可生物降解的胶原膜覆盖［15］。与微骨折或镶嵌软骨成形术相比，ACI的确可以修复较大的软骨缺损［16］。但是这种方法的主要局限性是软骨细胞获取时造成的伤害，以及后期修复时纤维软骨的形成。纤维软骨通常由于细胞扩增过程中软骨细胞的分化而发生，其机械性能和生物功能远低于天然的透明软骨［17］。第2代技术注重解决第1代技术的并发症问题，将含有自体软骨细胞（预先体外培养扩展）的特殊三维支架移植到软骨缺损区域中，即基质诱导自体软骨移植［18］。体外扩增的自体软骨细胞总是表现出软骨特异性Ⅱ型、Ⅳ型、Ⅵ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖的表达减少［19］和糖胺聚糖、非特异性Ⅰ型胶原蛋白的合成明显升高［20］。第3代技术总结了前2代技术的缺点与不足，开始采用异体细胞移植、传导基质材料及预先体外培养组织提高材料的生物力学以更利于移植［14］。近年来，随着更多新技术的兴起，包括组织3D打印、基因治疗、干细胞疗法，许多学者将这些技术与软骨组织工程结合形成了第4代软骨修复组织工程技术［14］。第4代技术因为在技术和细胞来源上具有一定复杂性，目前并没有得到广泛的应用。

近年来许多用于软骨修复的产品上市。如自体软骨移植（cartilage autograft implantation system，CAIS；DePuy/Mitek，Raynham，MA）和幼年软骨颗粒同种异体移植（DeNovo Natural Tissue，NT；ISTO，St.Louis，MO）。在短期临床研究中，这2种方法显示都是安全、可行和有效的，并且患者主观评分有所改善，MRI检查也显示缺损部位填充良好［21］。但是CAIS也有同ACI的缺点，即对于获取软骨部位的伤害。NT的缺点是存在疾病传播和免疫抑制的风险。另外还有Medipost公司生产的Cartistem产品（Cartistem；Medipost，Seongnam-si，Gyeonggi-do，Korea，http://www.medi-post.com），它主要的成分组成为同种异体人脐带血来源间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived MSCs，hUCB-MSCs）和透明质酸水凝胶。临床试验结果表明，由同种异体hUCB-MSCs和透明质酸水凝胶组成的新型干细胞为基础药物产品，在核心试验阶段和延长随访期间具有可接受的功效和安全性［22］。

软骨组织工程是一项综合工程学、材料学和生物学等多学科的策略，许多科学家试图开发一种生物移植物来治疗软骨缺损。其中涉及一些药物使用生物材料构建支架结合物理化学因素对合适的细胞进行包裹/黏附，或包载合适的生长因子等促软骨生成，从而促进软骨组织重建以达到缓解炎症疼痛和功能恢复［23］。软骨组织工程在基础实验研究和动物实验中得到巨大的进展，但是软骨组织的复杂性、药物或生长因子传输限制、血管化和宿主组织整合以及细胞分化调控等重要因素仍阻碍着其向临床转化跨越。见图1。

图1 软骨修复现状Figure 1 Current status of cartilage tissue engineering

2 软骨组织工程面对临床转化的挑战

2.1 生物材料支架由于软骨组织的特殊性，缺乏血管神经的特点以及低细胞密度（占总体积的5%），因此开发可以模拟软骨基质并在缺损部位恢复功能的生物材料成为重要的软骨组织工程的研究途径。用于软骨组织理想的生物材料需符合以下条件:①在生理的条件下易于调控；②具有良好的生物兼容性和生物降解性；③具有模拟软骨ECM特征和促进细胞软骨形成潜能的能力；④能够容易填补关节软骨内的缺损部位，并与周围的天然软骨组织黏合且不会轻易脱落；⑤在软骨修复期间具有良好的耐久性。目前为止，许多优良的生物材料包括天然材料和人工材料，在基础实验和动物实验上取得良好的效果。但是能够应用到临床转化的案例仍然十分稀少。

软骨组织本身虽然成分简单但是结构复杂，从浅至深分为4层结构:浅表层、中间层（转化层）、深层（放射层）、钙化层。在不同层面内软骨细胞的表型、细胞型态以及细胞外基质的结构都不尽相同［24］。生物材料支架的设计必须考虑到天然组织的化学和材料特性，以及细胞相互作用的复杂机制。因此软骨组织工程的生物材料设计遇到重重困难。第一，在模拟软骨高含水量和黏弹性的特点时，生物材料无法达到天然软骨的物理机械特性，既在膝关节运动和行走中的抗压抗磨损能力不足；第二，人工设计的生物支架仍然没有能力去模拟软骨本身的多层复杂结构，可能会导致新生软骨细胞表型的差异以及影响新生软骨的物理机械特性；第三，软骨损伤的病情具有多样性:多种病因（炎症、运动损伤、劳损）、不同损伤面积、不同损伤深度（是否损伤到软骨下骨）。因此这也会增加生物支架材料设计的难度。目前许多软骨组织生物材料并不能对所有的软骨损伤情况全面覆盖以及更有针对的治疗。大规模制造所需的生物材料用于临床治疗所面临的最明显的挑战是要为患者量身定做生物支架，所以要着重考虑解剖的异质性和生理学的特点，而不是“一刀切”；第四，我们还需要考虑的因素是材料本身的生物降解性和生物兼容性之间的平衡，和软骨组织功能恢复程度的关系。在有效的干预措施促进软骨生成的情况及保证生物兼容性的情况下，是否能够在足够的降解时间内完成一个较为理想的软骨修复，目前大部分的研究报道并没有讨论时间平衡的问题。

2.2 细胞疗法种子细胞是软骨组织形成持续维持的驱动力。细胞疗法是利用植入体外培养的细胞来刺激软骨自然再生的有效途径。目前为止，研究中用到的细胞包括成熟的软骨细胞、来自骨髓和滑膜的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）、诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）、胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和软骨前体干细胞（chondrocyte stem/progenitor cells，CSPCs）。大量研究表明，这些细胞具有形成关节软骨的能力，并且当植入软骨缺损部位时，能与天然软骨和软骨下骨结合。然而，到目前为止，对于软骨细胞的分化和再生修复机制并没有得到充分理解。因此，如何有效调控从植入的干细胞定向分化到特定软骨细胞仍然是一个令人困扰的问题。为了保证细胞外基质的有效形成和快速稳定循环，进一步研究如何将植入的干细胞导向生物材料中特定的软骨细胞系是十分必要的。另外，软骨组织根据其含有胶原蛋白的不同分为纤维软骨［富含一型胶原蛋白（collagenⅠ）］和透明软骨［富含二型胶原蛋白（collagenⅡ）］。透明软骨是关节软骨的主要成分，而纤维软骨是一种致密的纤维状软骨，缺乏透明软骨的抗压强度和无摩擦特性［2］。目前研究中软骨组织再生并不是理想的透明软骨形成。纤维软骨的存在与自体关节软骨移植存在类似的问题，缺乏整合和功能特性的不匹配并且限制了缺损部位的完全再生［25］。所以，如何定向诱导干细胞向软骨细胞分化，并且能够产生含有二型胶原细胞外基质的透明软骨是软骨组织工程中细胞疗法最重要的课题之一。

在软骨细胞的定向分化上，许多研究者开始采用LncRNA和甲基化修饰等表观遗传学的手段。许多研究证明，LncRNA在干细胞的分化尤其是软骨细胞的分化上起到重要作用［26］。LncRNA H19与关节软骨的发育具有紧密的联系。Zhao等［27］研究发现LncRNA H19能够通过竞争STAT2的miRNA调节，在脂肪间充质干细胞的软骨分化过程中发挥其重要调节功能。DNA甲基化是在CpG二核苷酸处向DNA添加甲基并将胞嘧啶残基转化为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。CpG序列通常聚集在约30%基因的启动子上的“岛”中。这些岛的甲基化与基因表达的抑制相关，DNA甲基化的重要功能是转座子的沉默［28］。对软骨和/或软骨细胞中的单个基因启动子的检查表明，对少数但功能上重要的CpG基因座DNA甲基化的精细调节，可对基因表达产生很大影响进而影响软骨细胞的定向分化［29］。有研究结果表明，软骨特异性基因DNA甲基化的差异调节可能有助于软骨细胞去分化。因此，这些基因的表观遗传学操作可能是抵消伴随体外繁殖的软骨细胞去分化和改善ACI治疗结果的潜在策略。但是目前关于LncRNA和DNA甲基化修饰等技术仍有待更深入的研究。

2.3 生物活性因子生长因子因其强大的增殖潜力，促合成代谢能力和抗异化能力而得到广泛的研究，包括转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）［30］。并且生物材料与生物活性因子的结合大大促进软骨组织工程的发展。在组织原位形成的生物材料，特别是水凝胶也被用作药物递送系统，使得药物在关节内得到控制并持续释放，这种系统可用于治疗关节炎或类风湿关节炎等关节疾病。比如Kartogenin（KGN），一种可以促进软骨生成的小分子蛋白，通过包载在可生物降解的PLGA纳米颗粒（nanoparticles，NPs）中，同时嵌入可光交联的丙烯酸化透明质酸注射水凝胶中，并且与透明质酸基质与KGN-NPs相结合后，KGN的释放速率在2个月的实验期间几乎无明显的突释现象［31］。更有研究者针对关节炎的病情程度不同，开发病情进展程度智能应答的水凝胶生物支架，它能够依赖一种小分子亲水分子，三聚甘油单硬脂酸酯（triglycerol monostearate，TG-18），并根据关节内炎性因子含量的浓度来释放治疗性药物［32］。目前对于此类活性因子的释放做了大量的研究，但是对于用于临床应用的软骨组织工程药物缓释，我们更高的目标是高效、智能、靶向、精准和持久性，而为此需要做更多的努力和工作。

在骨关节炎的发展进程以及软骨再生过程中，有许多生物信号通路参与其中。比如Wnt通路、TGF-β通路、BMP通路、MAPK通路、Hedgehog通路、NF-kB通路、PTHrP通路。在人类遗传学研究中，已经提出与Wnt/β-catenin信号传导相关基因的改变作为骨关节炎发展的易感因子［33］。从来自骨关节炎患者的关节软骨、骨和滑膜组织中Wnt相关基因表达发现，Wnt7b与骨关节炎进展关系最密切［34］。另外，TGF-β和BMP在软骨形成和骨生成中具有重要作用，其信号传导的突变引起广泛的骨骼疾病。这些研究不仅揭示了TGF-β和BMP信号在骨形成和体内平衡中的作用，而且还破译了相关骨病的分子机制和发病机制。MAPK是软组织中保守的信号转导系统之一，其在软骨形成分化中起关键作用。MAPK级联构成3个顺序激活的激酶复合物，包括p38 MAPK，c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和细胞外调节激酶（extracellular regulated kinase，ERK），其是MAPK激酶（MAPK kinases，MKKs）磷酸化的底物［35］。Hedgehog信号调节对正常骨骼发育和细胞功能至关重要［26］，在软骨内骨发育过程中，生长板中软骨细胞分化受严格控制的hedgehog信号通路激活的空间和时间调节［27］。NF-κB信号通路参与广泛的免疫应答、细胞生长分化等过程。对于软骨组织来说激活的NF-路参调节多种基质降解酶的表达，从而影响软细胞外基质蛋白的数量和重塑功能［28］。PTHrP在软骨细胞生物学中的生理作用具有重要作用［29］。PTHrP（-/-）突变小鼠骨骼生长板的显微镜结果显示，由于细胞分裂数量减少，软骨柱解体，静息和增殖的软骨细胞区域的高度显着降低。肥大区以及Ⅱ型胶原等基质分子的沉积明显减少［36］。众多信号通路同时参与软骨组织的形成和修复以及病理生理过程，他们之间又有复杂紧密的联系。如何安全有效的利用这些信号通路也是软骨组织工程跨向临床转化的障碍之一。

3 软骨组织工程面对临床转化的机遇

软骨修复仍然是骨科医师和生物研究者正在研究的热点和攻克的难题。随着技术的进步和更替，尽管软骨组织工程在模拟天然环境和增强软骨基质生成的能力逐步增强，而且在种子细胞生长定向分化的机制和药物缓释的研究上有了进展，但目前在多个方面仍未达到预期最好的效果，进入临床转化和临床应用仍有一定困难。对于软骨组织工程临床转化的要求是:①一个完整成熟的产品，并且可以直接投入应用；②操作上无需手术，可进行微创化；③能够牢固结合到天然软骨和天然软骨细胞表面，已达到最大效率的修复；④能够产生透明软骨以达到软骨重塑和功能恢复。

软骨修复技术产品的关键技术是生物材料支架的制备。目前软骨组织工程研发的支架包括天然的和人工的，依旧存在机械抗磨损能力差以及缺乏靶向修复的特性。因此研发令人满意的具有强机械应力以及智能的支架也是未来研究的重点。生物材料支架必须是具备良好的生物兼容性、智能性、抗机械磨损性，符合关节内软骨原有生物特性。3D组织打印技术、3D器官打印、水凝胶技术或更多的新兴技术都能为这一方面提供更多的突破。对于软骨重塑，目前仍然无法突破的瓶颈就是透明软骨的形成。软骨损伤后修复的软骨往往倾向于纤维软骨或软骨肥大化，这都非常不利于后期的功能恢复。对于这一问题需要解决的关键技术在于，首先诱导并定向分化种子细胞，形成透明软骨，或诱导纤维软骨或肥大化的软骨转变为透明软骨，而透明软骨是关节内生物及物理功能的基本保证。解决这一问题必须要从多个缓解综合突破研究出发，包括种子细胞的来源（软骨细胞、干细胞、异体或自体等）、培养细胞的方式（从原先的2D培养到3D支架内立体培养）、定向分化种子细胞（绳子因子干预、甲基化修饰）等多个角度。然后，对于参与软骨组织修复的生长因子以及信号通路众多繁杂，也有许多祖细胞或干细胞参与，并且相互影响相互作用，寻找最高效、最智能和最安全的信号通路同样也是软骨组织工程工作的方向。最后，在下一代软骨组织工程中应该结合更多技术，为工程组织提供更先进的功能。这其中包括在生物支架移植过程中可以监控组织和生物支架性能的能力，或者监控疾病状态的能力［37］。对支架外植物的实时监测能够使临床治疗在基于数据分析的方法下，对整个治疗过程进行微调。光学相关层析成像技术在眼科的临床应用可以作为细胞在生物支架中的定位提供一个有用的借鉴，使移植深度达到微米级［38］。MRI、PET和多光子成像技术的进展有助于生物材料支架内细胞的跟踪，以及整体性能的评估［39-40］。通过利用先进的成像策略在治疗中结合实时监测，可以实现更加个性化和可调节的治疗，以及在整个治疗周期中感知疾病状态的治疗诊断方法。

在过去软骨组织工程的基础研究和转化研究中，我们显著提高了对软骨发育、正常功能和病理功能的认识。软骨组织属于单细胞类型且分布稀疏，没有血管供应，但是它的应力基质及其结构和机械特性难以设计，目前成熟的针对软骨损伤治疗方法仍然距离真正的软骨修复成功还有很大距离，但是我们确信软骨组织工程是软骨损伤修复最有希望和潜力的治疗方法。

4 结 语

近几十年对软骨组织工程的新发现预示着软骨组织再生困难，这个困扰着我们的问题将最终得到解决。但是目前对于软骨损伤病理生理机制和软骨细胞生长分化机制的理解仍然不够全面，这也阻碍着软骨组织工程的发展和进一步的临床转化。未来，在临床医学、材料学、生物学、工程学等多学科交叉紧密合作下，获得天然透明软骨的技术必将日益成熟，软骨组织工程也必定会给众多软骨损伤的患者带来福音。