一种改良的Sprague Dawley新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法

杨 梅，范 围，黄 瑶，袁容娣

(中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院眼科，重庆 400037)

Müller细胞是视网膜特有的神经胶质细胞，也是视网膜内最重要的神经胶质细胞，在视网膜的病理、生理过程中扮演着重要角色[1]。数量上，它是视网膜内数量最多的胶质细胞；结构上，Müller细胞从光感受器开始至内界膜结束，横跨分布于整个视网膜，可维持视网膜的正常结构；功能上，其同时具备星形胶质细胞和少突胶质细胞的功能，可维持细胞微环境的平衡，还能分泌大量的神经营养因子，对视网膜神经元起到支持、滋养的作用。Müller细胞的体外培养技术可为视网膜病变的细胞生物学、发育学和电生理学等研究提供一个重要平台。因此，在体外建立稳定的Müller细胞培养体系对于研究Müller细胞在视网膜中的生理、病理作用具有重要意义。Müller细胞培养技术的关键是细胞纯化，细胞纯化方法主要有机械吹打法、恒温摇床法、胰蛋白酶消化法等[2-4]，这些方法均利用了Müller细胞较视网膜组织中其他细胞贴壁紧的原理。机械吹打法吹打力度和次数不易掌控，影响细胞的活性；恒温摇床法需要在摇床震荡4～6 h，在外界暴露时间过长，操作繁琐，还有加重污染的风险；而胰蛋白酶消化法虽较前2种方法简单，但在试验中发现，单纯用胰蛋白酶消化存在细胞纯度不高的问题，而过度消化又会损伤细胞。为了找到一种操作简单、细胞纯度更高的培养方法，作者结合本实验室条件，改良出一种Sprague Dawley(SD)新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法，此方法操作简单，获得的细胞纯度高，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物新生1～2 d的SD大鼠，雌雄不限，由陆军军医大学野战外科研究所实验动物中心提供，本研究经陆军军医大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器高糖达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM) 购自美国Hyclone公司，胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶购自美国Gibco公司，小鼠抗Vimentin单克隆抗体购自英国Abcom公司，荧光二抗(488)标记羊抗小鼠IgG购自英国Thermo公司，小鼠抗NeuN单克隆抗体购自美国Millpore公司；离心机、细胞培养箱、倒置荧光显微镜购自美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 Müller细胞原代培养将新生SD大鼠浸泡于体积分数75%乙醇中2 min，断头处死，摘除眼球，将眼球直接浸泡在含体积分数1%双抗(100 U·mL-1青霉素及100 g·L-1链霉素)的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中过夜。去除浸泡眼球的培养基，加入 2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中消化1 h，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM终止消化；将眼球移入另一个无菌培养皿中，在高倍显微镜下分离视网膜，收集于无菌离心管中，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM，反复吹打，制成细胞悬液，用70 μm的滤网过滤细胞悬液，调整细胞密度，按3×105L-1接种于培养瓶中，置于 37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱过夜；第2天观察细胞贴壁情况，更换培养液，继续培养6～8 d，细胞密度达到80%予以传代。

1.3.2 Müller细胞传代与纯化去除培养瓶中的培养基，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶液1 mL，轻晃培养瓶，1 min后吸除胰蛋白酶溶液，重复操作2次，以去除贴附能力较差的杂细胞，纯化Müller细胞。再加入2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液2 mL，反复吹打瓶底，镜下观察见细胞绝大部分变圆、悬浮，立即加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM 2 mL终止消化；将培养瓶中的细胞悬液全部转移至无菌离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，去上清液，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM，调整细胞密度，按3×105L-1接种于培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养4～6 d，细胞密度达到80%时进行传代。

1.3.3 视网膜神经元纯度鉴定收集第3代Müller细胞，以1.5×105L-1接种于放有载玻片的24孔板中，于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养48 h，去除培养基，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次3 min，40 g·L-1多聚甲醛室温下固定15 min，PBS洗3次，每次 3 min；体积分数0.1% Triton X-100 室温透膜 15 min，PBS洗3次，每次3 min；体积分数10%山羊血清封闭1 h，弃血清；加入一抗小鼠抗NeuN单克隆抗体(1：500)；另取一孔用PBS代替一抗做阴性对照，4 ℃ 孵育过夜。PBS洗3次，每次3 min，加入荧光二抗(488)标记羊抗小鼠IgG(1：300)，室温避光孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min，1：2 000的Hoechst33342染核2 min，PBS洗3次，每次3 min。取出孔底载玻片，防荧光淬灭封片剂封片。分别在载玻片上、下、左、右、正中5个方向随机取5个视野拍照，计数NeuN荧光(绿色)染色阳性细胞数目，神经元纯度=NeuN 阳性表达细胞数/Hoechst 33342核染阳性细胞总数×100%。。

1.3.4 Müller细胞纯度鉴定取“1.3.3”项下体积分数10%山羊血清封闭1 h的细胞，弃血清，加入一抗小鼠抗Vimentin单克隆抗体(1：100)，PBS代替一抗做阴性对照，4 ℃孵育过夜。去一抗，PBS洗3次，每次3 min，加入荧光二抗(488)标记羊抗小鼠IgG(1：300)，室温避光孵育1 h，去二抗，PBS洗3次，每次3 min，1：2 000的Hoechst33342染核 2 min，PBS洗3次，每次3 min。取出孔底载玻片，防荧光淬灭封片剂封片。分别在载玻片上、下、左、右、正中5个方向随机取5个视野拍照，计数Vimentin荧光染色阳性细胞数目，Müller细胞纯度=Vimentin阳性表达细胞数/Hoechst 33342核染阳性细胞总数×100%。

2 结果

2.1 原代及传代培养细胞生长情况培养24 h后，部分细胞已贴壁生长，散在分布；培养3 d后，细胞胞体狭长，密度约40%；培养6～8 d后，细胞已形成融合状态，细胞体变大，细胞质丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，密度约80%；传至第4代的细胞形态不一，有突起，细胞体宽大，细胞质丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，见图1。

2.2 神经元纯度鉴定将传至第4代的原代细胞行NeuN和Hoechst33342免疫荧光染色，各视野均无阳性表达细胞，提示无神经元共生长。

2.3 Müller细胞纯度鉴定传至第4代的细胞行Vimentin和Hoechst33342免疫荧光双染，镜下可见大量Vimentin阳性细胞，Müller细胞纯度>95%；见图2。

图1 传代培养至第4代的Müller细胞形态(倒置显微镜，×100)

A：Hoechst33342免疫荧光核染；B：Vimentin免疫荧光细胞质染色；C：A、B图的融合。

3 讨论

Müller细胞是视网膜特有的一种神经胶质细胞，在视网膜中发挥着重要的病理、生理作用，体外培养Müller细胞是研究其病理、生理作用的重要手段[5-6]。然而，SD大鼠视网膜中细胞成分复杂，除了Müller细胞外，还含有星形胶质细胞、血管内皮细胞、神经元、少突胶质细胞等，将其中的Müller细胞分离、纯化培养是该细胞培养方法的核心步骤。目前，根据Müller细胞比重、贴壁时间、黏着力、细胞寿命等方面的特性，培养和纯化Müller细胞的方法较多，但各有优劣。酶消化法[7-8]和恒温振荡法[9]是最常用的Müller细胞纯化方法，其原理均是利用Müller细胞较其他细胞容易贴壁的特点，对Müller细胞进行较好的分离和纯化，但也存在着早期神经元共生长、分离视网膜操作较困难、暴露于外界时间长、易污染等不足之处。

本研究对体外培养Müller细胞的方法进行了3个方面的改良。首先，取出眼球后将其浸泡于含体积分数1%双抗的无血清DMEM培养基中，在 37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中孵育过夜。在这个孵育过程中，眼球组织处于一种缺氧的状态，神经元和星形胶质细胞因耐受缺氧能力差而受损，而Müller细胞的耐受缺氧能力较强，在孵育过程中更利于其分裂[10]。而后，将眼球消化1 h，再分离视网膜，这与其他文献[11]报道的先分离视网膜，再对视网膜消化的方法也有所不同。本研究中，眼球被整个消化，更有利于分离视网膜。由于选取的动物较小，分离视网膜时较难操作，而眼球消化1 h后，体积有所增大，组织变软、变松，在去除眼前节时眼球不易滚动，更易操作，而视网膜也更易剥脱。在细胞传代时，由于Müller细胞的贴附性最强，用胰蛋白酶反复消化2次，留取最终仍然贴壁的细胞传代，以达到纯化Müller细胞的目的，较恒温震荡法节省时间，减少了细胞污染的机会，并且比其他酶消化法多使用一次胰蛋白酶消化，对Müller细胞的筛选更严格。

视网膜中存在3种胶质细胞，即Müller细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。Vimentin是视网膜中Müller细胞的特异性表达蛋白[12]，因此，本研究采用Vimentin鉴定Müller细胞，Vimentin荧光染色阳性的细胞为Müller细胞。本研究荧光染色鉴定结果显示，视野下无NeuN阳性核染细胞，说明无神经元共生长情况，而Vimentin阳性表达细胞占比>95%，均为Müller细胞。

综上所述。本研究改良的SD新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法操作简单，纯度高，是一种切实可行的实验方法。