阿托伐他汀抑制动脉粥样硬化患者NLRP3炎性体途径的研究

李奕萍 王红琴 王健 郑文华 陈建忠

动脉粥样硬化（AS）多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起，常导致血栓形成、供血障碍等，也是冠心病等心血管疾病的首要病因。目前研究表明，AS是一种慢性炎性疾病，炎症反应在AS的发生发展中起了重要作用[1]，尤其是免疫应答介导的炎症反应[2]。有学者提出含热蛋白结构域3的核苷酸结合寡聚化样受体（NLRP3）炎性体激活途径[3]在AS发生、发展过程中起着关键的作用[4-5]。他汀类药物是冠心病、高血压以及脑血管病的预防药物，其中阿托伐他汀进入体内不需代谢即可有生物活性，具有见效快、降脂作用强以及持续时间长等优点，可有效降低心血管疾病的发病率和病死率。阿托伐他汀治疗心血管疾病的原理在于它可抑制内皮细胞、平滑肌细胞以及巨噬细胞（MDM）的增殖和转移，但其对NLRP3炎性体的调节作用报道较少。本研究通过观察阿托伐他汀治疗前后AS患者NLRP3炎性体相关分子的表达和IL-1β、IL-18等细胞因子的变化，以及体外阿托伐他汀对NLRP3炎性体活化途径的调节作用，探讨阿托伐他汀治疗AS的免疫学机制。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年1月至2016年12月在本院诊治的AS患者30例，均经超声检查确诊。入选标准：（1）经超声检查确诊为AS，即血管内膜增厚，内-中膜厚度1.0~1.2mm或管腔内粥样硬化斑块形成、管腔狭窄；（2）既往未接受过阿托伐他汀类药物治疗。排除标准：（1）有急性感染的临床表现；（2）严重肾功能衰竭；（3）患有痛风、类风湿疾病、糖尿病、恶性肿瘤或其他严重消耗性疾病；（4）长期服用激素或免疫抑制剂。患者中男 18 例，女 12 例；年龄 50~81（70.1±8.6）岁；收缩压（SBP）为（125.56±18.98）mmHg，舒 张 压（DBP）为（82.39±8.09）mmHg，空腹血糖 （5.98±2.14）mmol/L，TC（5.21±1.09）mmol/L，HDL-C 为（1.38±0.41）mmol/L，LDLC 为（3.07±0.88）mmol/L，TG 为（1.96±1.16）mmol/L。

1.2 主要试剂和仪器 立普妥（阿托伐他汀钙片）购自美国辉瑞制药有限公司，（规格：20mg/片，批号：M91692）；淋巴细胞分离液购自挪威Stem cell公司，脂多糖（LPS）、胆固醇、佛波酯（PMA）均购自美国 Sigma-Aldrich公司，IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒均购自美国eBioscience公司，Trizol试剂盒和SuperRT cDNA第一链合成试剂盒均购自江苏康为世纪生物科技有限公司，尼日利亚菌素购自美国Invivogen公司，NLRP3、ASC、IL-1β引物自行设计后由上海生工生物工程技术有限公司合成，定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.3 IL-1β和IL-18在血浆和单核细胞来源的MDM中表达水平的检测 采用ELISA法。患者在阿托伐他汀治疗（20mg/d，口服）前1d以及治疗后2个月分别采集空腹静脉血10ml，肝素抗凝，以1 200r/min离心10min，收集血浆于试管中，-80℃冰箱保存待检；将分离血浆后的剩余细胞用PBS稀释1倍后，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，单个核细胞再分化为MDM，用胆固醇结晶刺激，收集细胞悬液上清液于试管中，-80℃冰箱保存待检。IL-1β和IL-18表达水平检测按照ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处吸光度（A）值，以试剂盒提供的标准品测定结果绘制标准曲线，计算IL-1β和IL-18的表达水平。

1.4 NLRP3炎性体相关分子和IL-1β mRNA表达水平的检测 采用实时荧光定量PCR法。将MDM根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA，加入20μl的焦碳酸二乙酯水溶解，测定RNA的浓度和OD比值，符合要求后按照SuperRT cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录反应，20μl反应体系中包括 dNTP mix 4μl，SuperRT 1μl，5×RT Buffer 4μl，RNA 2μl，引物 2μ1，DEPC水7μl，反应物4℃储存待用。实时荧光定量PCR根据参考文献进行，20μl反应体系中含 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR 上游和下游引物各 1μl，逆转录反应液（cDNA 溶液）2μl，DEPC 水 6μl，在定量 PCR 仪上进行反应，反应条件为 95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，40个循环，每个样品设定3个复孔，并使用溶解曲线分析引物特异性。用2-ΔΔCt法计算出每组样本的mRNA表达量，每种检测重复3次。引物根据文献报道设计和合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 阿托伐他汀对单核巨噬细胞株（THP-1）NLRP3炎性体激活的调节作用 THP-1细胞用50nM PMA处理24h分化为MDM。为观察不同浓度阿托伐他汀对NLRP3炎性体激活途径的影响，用尼日利亚菌素单独或联合不同浓度阿托伐他汀处理细胞30min，分组如下：单独尼日利亚菌素处理组为对照组，尼日利亚菌素联合1μmol/L阿托伐他汀处理组为低浓度组，尼日利亚菌素联合10μmol/L阿托伐他汀处理组为中浓度组，尼日利亚菌素联合20μmol/L阿托伐他汀处理组为高浓度组。为观察阿托伐他汀处理时间对NLRP3炎性体激活途径的影响，用尼日利亚菌素单独或联合10μmol/L浓度阿托伐他汀不同时间处理细胞，分组如下：单独尼日利亚菌素处理组为对照组，尼日利亚菌素联合10μmol/L阿托伐他汀处理12、24、48h为12h组、24h组、48h组。具体操作流程：在用10μmol/L阿托伐他汀处理MDM不同时间后，加入10μmol/L的尼日利亚菌素作用30min，收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β和IL-18的表达水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件。计量资料以表示，组间比较采用配对t检验。P＜0.05为统计学有意义。

2 结果

2.1 AS患者治疗前后血浆中IL-1β、IL-18表达水平的比较 30例AS患者经阿托伐他汀治疗后，IL-1β和IL-18在血浆中的表达水平均低于治疗前，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 30例AS患者治疗前后血浆中IL-1β、IL-18表达水平的比较（pg/ml）

2.2 AS患者治疗前后MDM中IL-1β、IL-18表达水平的比较 30例AS患者经阿托伐他汀治疗后，IL-1β、IL-18在MDM中的表达水平均低于治疗前，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 30例AS患者治疗前后MDM中IL-1β、IL-18表达水平的比较（pg/ml）

2.3 AS患者治疗前后NLRP3、ASC和IL-1β mRNA表达水平的比较 30例AS患者经阿托伐他汀治疗后，MDM中NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表达水平均低于治疗前，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 30例AS患者治疗前后NLRP3炎性体相关分子mRNA表达水平的比较

2.4 阿托伐他汀不同浓度与不同处理时间对THP-1细胞分泌IL-1β、IL-18抑制作用的比较 与对照组比较，低、中、高浓度组IL-1β和IL-18的表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且随着阿托伐他汀浓度越大，下降越明显，见表5。与对照组比较，12、24、48h组IL-1β和IL-18的表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且随着处理时间越长，下降越明显，见表6。

表5 不同浓度阿托伐他汀对THP-1细胞分泌IL-1β、IL-18 的抑制作用（pg/ml）

表6 不同时间阿托伐他汀处理对THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18的抑制作用（pg/ml）

3 讨论

AS是一种以脂质沉积、白细胞浸润和血管平滑肌细胞增殖为主要特征的慢性炎症性疾病，但是到目前为止，导致AS发生的分子机制尚未完全阐明[1]，但免疫应答引起的炎症反应与其密切相关[2]。近年来研究表明，损伤的组织和细胞产生的损伤/危险相关分子模式（DAMPs）能被模式识别受体（PRR）识别后介导炎症反应的发生。这些模式识别受体包括Toll样受体（TLR）、核苷酸结合寡聚化样受体（NLR）、视黄酸诱导基因样受体（RLR）和C型凝集素样受体（CLR）等，其中NLR识别DAMPs后能形成由NLR、接头蛋白ASC、Caspase-1等形成的称为炎性体的分子的复合物[3]。炎性体形成后能激活Caspase-1，活化的Caspase-1继而通过酶切IL-1β和IL-18前体分子而生成具有生物学活性的IL-1β和IL-18，进而调节炎症反应。NLRP3炎性体是研究最多的一种，NLRP3炎性体由NLRP3、ASC和Caspase-1组成的[4]。多种内源性刺激物如胆固醇结晶、葡萄糖、游离脂肪酸、尿酸钠（MSU）结晶及胞质外ATP和外源性刺激物如细菌、病毒等成分均能诱导NLPR3的活化，通过诱导促炎性细胞因子如IL-1β的产生，其在AS[4-6]、糖尿病[7]、阿尔茨海默病[8]、痛风[9]等免疫炎症性疾病中的作用日益受到重视。

近年来研究发现固有免疫细胞如MDM、内皮细胞吞噬游离脂肪酸（FFA）、胆固醇结晶后，可激活炎性体途径，释放炎症因子如IL-1β、TNF-α等，在AS的发生、发展中起到重要的作用[4-6]。如研究发现胆固醇结晶能激活MDM炎性体的形成，并发现氧化低密度脂蛋白能促进胆固醇结晶的形成并作为初始信号促进NLRP3和IL-1β的表达[5]。本课题早期研究[6]与相关报道均发现，AS患者血浆中的IL-1β和IL-18的水平显著高于对照组，其中分离的外周血单个核细胞进一步分化为MDM，定量 PCR 法检测发现 NLRP3、ASC、IL-1β 的mRNA表达显著高于对照组，用一定浓度的胆固醇结晶刺激后发现AS患者的MDM的TNF-α、IL-1β的分泌水平均显著高于对照组，提示AS患者可能存在慢性低度炎症状态，NLRP3炎性体激活与AS的发生、发展有关。此外，AS患者的大动脉[10]、颈动脉硬化斑块[11]和皮下脂肪组织[12]中均发现NLRP3炎性体相关分子如NLRP3、ASC等表达升高，且与疾病的严重性相关。文献报道，NLRP3炎性体激活可导致消皮素D（GSDMD）分子的活化，后者可在细胞膜上形成孔道，有利于促进IL-1β的分泌[13]，在AS患者中GSDMD是否表达升高目前还没有报道，但由于活化的GSDMD是IL-1β分泌的必需成分，推测可能与其活性升高密切相关。以上结果提示由胆固醇结晶刺激引起的NLRP3炎性体激活途径可能在AS的发生、发展中起到重要的作用。有关胆固醇结晶激活NLRP3炎性体的分子机制，有学者推测胆固醇结晶被MDM吞噬后可导致吞噬溶酶体的不稳定性或破裂，引起溶酶体的组织蛋白酶B释放激活NLRP3 炎性体[4-5]。

他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA） 还原酶抑制剂，因其降脂作用强效、稳定、安全，临床上已被广泛用于高脂血症的治疗与预防[14-15]。近来的临床研究大量数据已经证明他汀类药物在冠心病患者中除有降脂作用外还具有改善内皮功能、稳定斑块及抗AS的作用，其中上述作用机制的分子机制涉及到他汀类药物的抗炎作用[14]。C-反应蛋白（CRP）是反应机体炎症的敏感治疗，近期有研究显示，冠心病患者在使用阿托伐他汀后，CRP水平明显下降，表明阿托伐他汀具有抗炎效应[14]，但其调控机制不甚清楚。另外，在对心力衰竭的患者研究中发现，他汀药物具有降低血清中细胞炎症因子的效应，从而发挥抗炎作用。随着NLRP3炎性体在AS发病中的作用被揭示，其在临床治疗中相关性日益受到关注，如研究报道急性心肌梗死和不稳定型心绞痛患者经高剂量的瑞舒伐他汀钙片（20mg/d）治疗4周后，血浆中IL-1β和IL-18水平显著下降[16]，但也有报道冠心病患者在经瑞舒伐他汀治疗8个月后，NLRP3炎性体相关分子表达和血浆中IL-1β和IL-18水平没有变化，但是阿托伐他汀治疗能引起IL-1β和IL-18显著下降[17]，这些结果不一致可能与剂量和观察时间不同有一定的关系。本研究发现AS患者经阿托伐他汀治疗一段时间后，血浆中IL-1β和IL-18下降，NLRP3炎性体相关分子如NLRP3、ASC等表达也降低，体外细胞实验发现，一定浓度的阿托伐他汀药物能抑制经尼日利亚菌素刺激后THP-1细胞产生IL-1β和IL-18，且呈剂量依赖性，表明阿托伐他汀药物在体内可能对胆固醇结晶诱导的炎性体激活具有抑制作用，从而在AS的治疗中发挥作用。有学者报道阿托伐他汀药物能通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号途径抑制THP-1细胞中NLRP3炎性体激活[18]，另有研究发现PKA能通过引起NLRP3蛋白291丝氨酸位点磷酸化和泛素化修饰抑制NLRP3炎性体的激活，从而改善炎症性疾病的病理发生[17]，而早期文献报道阿托伐他汀能通过激活PKA抑制葡萄糖反应元件结合蛋白的功能[20]，目前本研究团队正在研究阿托伐他汀是否也能通过激活PKA而抑制NLRP3炎性体激活。

本研究发现AS患者经阿托伐他汀治疗后血浆IL-1β和IL-18水平显著下降，同时MDM中NLRP3炎性体相关分子的表达水平和胆固醇结晶刺激后MDM产生IL-1β和IL-18的水平经治疗后也显著降低，体外细胞实验发现阿托伐他汀药物能抑制尼日利亚菌素刺激THP-1细胞产生IL-1β和IL-18，提示阿托伐他汀在体内可能通过抑制NLRP3炎性体的激活而在AS的治疗中发挥作用，本研究结果为进一步研制开发有效的AS治疗药物提供了一定的思路。

（收稿日期：2017-08-28）

（本文编辑：俞骏文）