重组人甲状旁腺激素1-34对豚鼠骨关节炎的改善作用

王罗春 洪敏

摘 要 目的：评估重组人甲状旁腺激素1-34（PTH1-34）对豚鼠自发性骨关节炎的作用。方法：采用6月或10月龄豚鼠，每天皮下注射生理盐水或PTH1-34或复泰奥3个月，考察II型胶原C端肽CTX-2、骨钙素OC、组织病理学OARSI评分、骨体积分数BV/TV及骨小梁模式因子Tb.pf等指标。结果：6月龄豚鼠给药后，PTH1-34或复泰奥可降低CTX-2水平、OARSI评分、Tb.pf，提高BV/TV，对豚鼠骨关节炎有改善作用；PTH1-34 30及60 mg/kg改善明显，停药1个月后30 mg/kg组仍可见明显骨改善。10月龄豚鼠PTH1-34给药后雌性动物Tb.pf明显低于对照，认为存在骨改善。结论：PTH1-34对6月龄豚鼠骨关节炎有明显改善作用，对10月龄豚鼠也有一定程度骨质量改善。

关键词 骨关节炎 重组人甲状旁腺激素1-34 复泰奥

中图分类号：R977.14； R965 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）15-0103-05

Effects of recombinant human parathyroid hormone 1-34 on osteoarthritis in guinea pigs*

WANG Luochun1**， HONG Min2

（1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research / Shanghai InnoStar Bio-Tech Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the effects of recombinant human parathyroid hormone 1-34 （PTH1-34） on spontaneous osteoarthritis in guinea pigs. Methods： Six or ten months-old guinea pigs were subcutaneously injected daily with saline， PTH1-34 or Forsteo for 3 months. The changes of C-telopeptides of type II collagen （CTX-2）， osteocalcin （OC）， histopathological OARSI score， bone volume fraction BV/TV， and bone trabecular pattern factor Tb.pf were observed. Results： CTX-2 levels， OARSI score and Tb.pf were decreased while BV/TV was increased in 6-month-old guinea pigs after administration of PTH1-34 or Forsteo compared with saline control， which indicated that PTH1-34 or Forsteo could improve guinea pig osteoarthritis and furthermore， the improvement was more significant in guinea pigs with PTH1-34 dosage 30 or 60 mg/kg. Bone improvement was still visible in guinea pigs with PTH1-34 30 mg/kg after 1 month recovery. The Tb.pf level in female 10 months-old guinea pigs was significantly lower than that of the control after PTH1-34 was administered， which was considered that there existed bone improvement. Conclusion： PTH1-34 has a significant improvement effect on spontaneous osteoarthritis in 6 months old guinea pigs， while only a certain degree of improvement in 10 months old guinea pigs.

KEy WORDS osteoarthritis； recombinant human parathyroid hormone 1-34； Forsteo

骨關节炎（osteoarthritis， OA）是由多种因素引起关节软骨病变而导致以关节疼痛为主要症状的退行性疾病，严重影响生活质量。OA发生与年龄相关，中老年人发病率高，65岁以上人群50%以上为OA患者。目前OA药物治疗如镇痛药物、关节腔注射药物等，仍然是以缓解疼痛、延缓疾病进展为主，无法有效治疗或改善骨关节炎疾病进程[1，2]。

以重组人甲状旁腺激素1-34（recombinant human parathyroid hormone 1-34， rhPTH1-34）为活性成分的上市产品复泰奥（FORSTEO， teriparatide）是美国礼来公司研发，用于治疗骨质疏松的生物药物[3，4]。研究表明，复泰奥对模型大鼠、小鼠、猴、或兔的骨损伤或关节软骨损伤修复都具有较好的作用，目前复泰奥正被用于一项治疗OA的Ⅱ期临床探索性研究[5-9]。豚鼠2月龄膝关节组织结构正常，3月龄开始病变，4～6月龄骨关节炎逐步加重，9月龄关节软骨逐步降解，因此豚鼠随月龄自然发生的骨关节炎是与人骨关节炎病变机制最为接近的动物模型[10-13]。本研究考察重组人甲状旁腺激素1-34注射液（PTH1-34）对豚鼠骨关节炎的改善情况，以便为本品新药开发临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试药物

重组人甲状旁腺激素1-34（简称PTH1-34）（上海复旦张江生物医药股份有限公司研制，无色澄清液体，批号20140501、20141001、20141101）；复泰奥（Eli Lilly and Company市售，无色澄清液体，批号C104325E、C174138D）。每日给药前将供试药物用灭菌生理盐水稀释至适当浓度，置2～8 ℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物

豚鼠为Hartley-Dunkin品系，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号11400700049877（雌性）、11400700050386（雄性）；豚鼠骨关节炎随月龄自然发生。

1.3 关键实验器材

SkyScan1076型Micro CT（比利时Skyscan 公司）。

1.4 动物分组与给药剂量

实验动物分组及给药情况详见表1；实验共分8组，采用不对称设计。第1～5组为6月龄豚鼠，以随机分组方式减少组间差异，分别皮下注射生理盐水或PTH1-34 15、30或60 mg/kg或复泰奥30 mg/kg，每天一次，给药3个月后考察；生理盐水和PTH1-34 30 mg/kg组恢复1个月后再次考察。第6～8组为10月龄豚鼠，随机分组，分别皮下注射生理盐水或PTH1-34 15或30 mg/kg，每天一次，给药3个月后考察。

1.5 考察指标及方法

1）Ⅱ型胶原C端肽（CTX-2） 豚鼠给药后各组各期随机采集5～6只动物全血各约1 ml，分离血清，用 Mybiosource公司ELISA 试剂盒检测[14]。

2）骨钙素（osteocalcin，OC） 豚鼠给药后各组各期随机采集5～6只动物全血各约1 ml，分离血清，用Mybiosource公司ELISA试剂盒检测[15]。

3）组织病理学评分（OARSI评分） 豚鼠给药后各组各期随机采集4～5只动物膝关节标本进行关节软组织连续切片，再用Safranin O Fast Green染色来评估OARSI评分[16]。

4）骨体积分数（BV/TV）和骨小梁模式因子（Tb. pf） 豚鼠给药后各组各期随机采集5～6只动物膝关节标本进行Micro CT扫描，获得BV/TV和Tb.pf参数结果[17]。

2 结果与分析

2.1 CTX-2检测

CTX-2反映软骨损伤，6月龄豚鼠给药各组各期随时间进展CTX-2逐渐升高；10月龄豚鼠由于骨关节炎进展严重（与2.3、2.4结果相印证）未见CTX-2与时间的相关性。总体上，该指标结果反映了与月龄相关的骨关节炎进程（表2、表3）。

6月齡豚鼠连续给予PTH1-34或复泰奥3个月后，雌性动物CTX-2水平呈降低趋势，停药1个月后仍可见药效作用；雄性动物未见明显改变。10月龄豚鼠由于动物骨关节炎进展严重，检测数据变异度较大，各组间未见统计学显著性差异。

2.2 OC检测

OC水平变化反映成骨细胞的活性和骨转换的程度，总体上OC水平在豚鼠骨关节炎中变化不明显。但是，部分豚鼠（如6月龄雄性豚鼠PTH1-34 15 mg/kg组、复泰奥30 mg/kg组，及10月龄雄性豚鼠PTH1-34 15 mg/kg组）给药3个月后，OC水平比同期生理盐水组都有所提高，提示有改善作用。（表4、表5）。

2.3 组织病理学OARSI评分

OARSI评分（等于Grade×Stage）反映关节软骨损伤的程度，6月龄豚鼠生理盐水组Grade、Stage、及OARSI评分值均随着时间推移而升高，反映了6月龄豚鼠给药3个月及恢复1个月的骨关节炎进程（表6～表8）。

6月龄豚鼠PTH1-34 30 mg/kg组给药2个月后， OARSI分值出现改善趋势，雌性动物改善50%～80%，雄性动物则改善较小；给药3个月，PTH1-34各剂量组及复泰奥组雌雄动物均出现改善趋势，其中PTH1-34 15 mg/kg组改善10%～30%，其它给药组改善50%～85%。恢复期1个月时，可能由于豚鼠骨关节炎进展严重，组间变化程度相当。

10月龄豚鼠由于骨关节炎进展程度严重，镜下难以判断OARSI分值差异（表9）。总之，6月龄豚鼠连续给予PTH1-34或复泰奥2～3个月，对豚鼠骨关节炎软骨损伤的进展有一定的改善作用。

2.4 BV/TV和Tb.pf的参数

BV/TV反映骨形成的代谢状况，Tb.pf反映成骨质量（Tb.pf数值与骨质量成反比），6月龄豚鼠生理盐水组雌性和雄性动物的TV/BV和Tb.pf各期间无明显变化，反映对照组动物在骨关节炎发展过程中骨形成和骨质量均维持在同一水平（表10、表11）。

6月龄豚鼠PTH1-34或复泰奥给药后各组各期，BV/TV均明显升高，Tb.pf均明显低于同期生理盐水组，即骨质量明显提高。恢复期1个月仍可见药效学作用。 10月龄豚鼠PTH1-34给药3个月均可见BV/TV有升高和Tb.pf有下降的趋势；但是由于动物变异度较大，仅雌性动物Tb.pf存在统计学显著性差异（表12）。

3 讨论

6月龄豚鼠PTH1-34 30 mg/kg给药2个月后CTX-2水平均高于生理盐水组，机制尚不清楚。

10月龄豚鼠给药后，出现多组给药1個月CTX-2数据高于本组给药3个月的结果，组内差异度大于均值，组间数据变化较大、没有规律（表3）。分析认为，这主要是由于在豚鼠骨关节炎发生与进展过程中关节软骨先是经历细胞肥大、增殖、和降解的过程，此时CTX-2随病情进展而升高（6～9月龄）；随着病情加重，关节软骨逐步消融，此时CTX-2达到高峰后迅速降低（10～12月龄）[16]，因此会出现表中3个月结果低于1个月结果的情形。同时由于到后期各动物个体病情进展差异较大，导致组内差异度大于均值、组间数据变化没有规律。

另外，本研究中各项考察指标各组各期的检测结果差异度都比较大，这是由于各组内动物个体骨关节炎进展差异所造成的。后续研究可以在动物随机分组前，通过限定入组豚鼠的体重范围、增加入组前早期骨关节炎生物标志物（如CTX2）检测等措施来缩小个体差异，从而保障研究数据的均一性。

总体而言，除骨钙素OC指标不敏感外，CTX-2、OARSI评分、BV/TV、及Tb.pf均能较好地反映豚鼠自发性骨关节炎的进展，显示PTH1-34或复泰奥对豚鼠骨关节炎的治疗或改善作用。6月龄豚鼠给药后，CTX-2水平、OARSI评分（包括Grade和Stage）、BV/TV及 Tb.pf均显示PTH1-34或复泰奥对豚鼠明显的骨改善，其中15 mg/kg改善较少，30及60 mg/kg改善明显，停药1个月后PTH1-34 30 mg/kg组仍可见明显的改善作用。10月龄豚鼠由于病程进展严重，给药后CTX-2、ORASI评分均不能区分骨关节炎的改善情况；但是在MicroCT检查中，PTH1-34 15及30 mg/kg组雌性动物的Tb.pf明显低于对照组，认为存在骨改善。本试验条件下，PTH1-34对6月龄豚鼠骨关节炎有明显改善作用，对10月龄豚鼠也有一定程度的骨质量改善。

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