桑黄黄酮、多糖高产优良菌株的筛选试验

谢春芹 杨鹤同 吴琴燕

摘要：为了筛选出黄酮和多糖产量较高的优良桑黄菌株，对17株桑黄菌株的生物量、黄酮和多糖含量及总产量进行分析，采用酵母提取物麦芽糖完全培养基（CYM）液体培养基对17株不同的桑黄菌株发酵培养7 d，收集液体菌丝，烘干至恒质量后测定菌丝干质量，用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定菌丝黄酮含量，用苯酚-硫酸法测定菌丝多糖含量。结果表明：在17株桑黄菌株中，生物量最大的是JNSH-14，达到0.645 g/100 mL;黄酮产量最大的是JNSH-15，达到42.048 mg/L;多糖产量最大的是JNSH-15，达到834.146 mg/L。由研究结果可以看出，JNSH-15菌株无论是在生物量还是总黄酮、总多糖产量方面，都处于较高水平。研究结果可为下一步桑黄黄酮、多糖发酵工艺优化中发酵菌株的选择提供参考依据。

关键词：桑黄;黄酮;多糖;菌株

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0209-04

桑黄（Phellinus spp.）在分类学上属于真核真菌亚界（Eukaryomycota）真菌门（Eumycota）担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）多孔菌目（Polyporales）锈革孔菌科（Hymenochaetacae）针层孔菌属（Phellinus）[1]，在我国有着悠久的应用历史，最早在李时珍所著的《本草纲目》中就已经有了关于桑黄的记载，常用于治疗内脏下垂、脱肛泻血、血崩气血两虚等症状[2-4]。日本学者IkeKawa等在1968年研究发现，桑黄（Phellinus linteus）子实体提取物具有非常好的抗癌效果，对小鼠肉瘤S180的抑制率可达96.7%，对正常细胞无毒害作用[5-6]。现代医学研究证实，桑黄提取物对小鼠肝癌H22、肉瘤s180、肺癌Lewis[7]、脑胶质瘤U251[8]、乳腺癌细胞MCF-7[9]、人源性结肠癌细胞HT-29[10]等均有良好的抗瘤作用，同时可以提高人体免疫能力，保护肝脏，治疗关节炎等[11-12]。这些都使得桑黄的研究成为人们关注的熱点，使其在药品研发与临床应用领域以及保健品开发领域有着广阔的应用前景。

桑黄广泛的药理功能得益于其多种多样的化学成分，现代生物学研究发现，桑黄的主要化学成分有多糖、黄酮、香豆素、氨基酸、萜类物质和酚类物质等，其中具有较强生物学活性的有效成分主要是多糖、黄酮和三萜等[13-14]，其中又以多糖、黄酮的研究最为系统。多糖存在于子实体、菌丝体和发酵液中，分为子实体多糖、菌丝体胞内多糖（intracellular polysaccharide，简称IPS）和胞外多糖（extracellular polysaccharide，简称EPS）[15-16]，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖等功效[2]。子实体多糖以杂多糖为主，研究发现的主要单糖有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、树胶醛糖、果糖、木糖[17-18]。黄酮类化合物是桑黄抗氧化作用的重要物质，总黄酮含量可作为桑黄抗氧化效用的评价标准[19]。现代药理学研究表明，桑黄黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗肝纤维化、增强免疫的作用[20-21]。

本研究通过液体发酵培养，比较17株桑黄菌株的生物量和黄酮、多糖含量，从中筛选出桑黄黄酮、多糖总产量较高的菌株，以期为生产上桑黄的液体发酵高效生产提供优良菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 17株桑黄菌株（JNSH-1～JNSH-17）保存于南京农业大学生命科学学院应用真菌实验室，各类菌株的来源见表1。

1.1.2 培养基 菌种活化用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基[22]，配方如下：200 g马玲薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂粉，1 000 mL水。配制方法同常规，装量为8 mL/平皿（直径为5 cm），倒板后冷却，备用。

种子液体培养基为PDA液体培养基，配方如下：200 g马玲薯，20 g葡萄糖，1 000 mL水。配制方法同常规，装量为 100 mL/瓶（三角瓶容量为250 mL），灭菌后冷却，备用。

液体发酵培养培养基为CYM（酵母提取物麦芽糖完全培养基），配方如下：10 g麦芽糖，20 g葡萄糖，2 g酵母提取物，2 g 蛋白胨，0.5 g MgSO4·7H2O，4.6 g KH2PO4，1 000 mL去离子水。配制方法同常规，装量为100 mL/瓶（三角瓶容量为250 mL），灭菌后冷却，备用。

1.1.3 试剂与溶液 主要试剂有5% NaNO2、浓硫酸、70%乙醇、10%葡萄糖、Al（NO3）3、芸香苷（纯度>95%）、4% NaOH、6%苯酚。

1.1.4 仪器设备 主要仪器设备有28 ℃恒温培养箱、烘箱、722型可见分光光度计、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、超净台、台式高速离心机、高压蒸汽灭菌锅、酶标仪等[22]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种平板的活化 从冰箱保存的斜面试管菌种（母种）中挑取1小块菌饼块，接种于PDA固体平板培养基中央，于28 ℃恒温培养箱中静置培养。

1.2.2 桑黄一级种的制备 用250 mL三角瓶分装PDA液体培养基，每瓶装100 mL，高压灭菌后使用。用直径为6 mm的无菌打孔器在活化的平板菌种上选取活力较高的靠近菌丝边缘的菌丝打孔[19]，挑取8块带有培养基的菌丝接种于三角瓶内，于150 r/min、28 ℃恒温摇床中培养7 d。

1.2.3 二级摇瓶发酵培养 用250 mL三角瓶分装CYM液体培养基，每瓶装100 mL，高压灭菌后使用。将制备好的一级种在无菌条件下用组织匀浆破碎机打碎，按4%的接种量接种到CYM液体培养基中，于150 r/min、28 ℃恒温摇床中培养7 d。

1.2.4 菌丝生物量的测定 发酵培养7 d后，将菌丝球用20目筛网收集起来，于清水下冲洗，直至培养基完全被洗净，再将菌丝平摊于已称质量的无纺布上，在烘箱中于60 ℃烘干，称量此时的质量，得到菌丝干质量。

1.2.5 黄酮含量的测定 精确称取0.05 g菌丝粉末，加入 5 mL 70%乙醇，放入超声清洗机中超声1 h，获得萃取液。取1 mL提取液，用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定黄酮含量。用0.1 mg/mL芸香苷标准品制作标准曲线，计算桑黄中的黄酮含量[22]。

1.2.6 胞内多糖含量的测定 将菌丝烘干研磨成粉末后，精确称取0.05 g粉末，加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，沸水浴 1 h，吸取提取液备用。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，用1 mg/mL葡萄糖标准溶液绘制标准曲线[23-24]。

1.2.7 数据统计与分析 每组试验都以3组生物学重复的“平均值±标准差”作为最终结果。对试验结果进行多重比较分析，不同小写字母代表在0.05水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 17株桑黄菌株菌丝干质量的比较

用CYM培養基对17株不同的桑黄菌株进行发酵培养，测定菌丝干质量。如图1所示，不同菌株间的生物量差异较大，在0.054 ～0.645g/100 mL之间;生物量较高的菌株有JNSH-14、JNSH-15、JNSH-1、JNSH-9、JNSH-5、JNSH-2，分别达到6.45、5.87、5.44、4.65、4.34、4.18 g/L。

2.2 17株桑黄菌株菌丝黄酮含量的比较

如图2所示，17株桑黄菌株的黄酮含量有一定差异，在0.116 ～0.717mg/100 mg之间。黄酮含量较高的菌株有JNSH-15、JNSH-2、JNSH-5，分别达到0.717、0.589、0.532 mg/100 mg。

2.3 17株桑黄菌株菌丝多糖含量的比较

如图3所示，17株桑黄菌株的多糖含量差异相对较小，在6.778 ～15.876mg/100 mg之间。桑黄多糖含量较高的菌株有JNSH-8、JNSH-12、JNSH-15，分别达到15.876、15.106、14.218 mg/100 mg。

2.4 17株桑黄菌株菌丝总黄酮产量的比较

为了综合比较各桑黄菌株的产黄酮特性，计算17株桑黄菌株的总黄酮产量。如图4所示，JNSH-15菌株的总黄酮产量最高，达到42.048 mg/L;JNSH-2、JNSH-5、JNSH-14的总黄酮产量较高，分别达到24.645、23.086、20.634 mg/L;其他桑黄菌株的总黄酮产量较低。

2.5 17株桑黄菌株菌丝总多糖产量的比较

为了综合比较各桑黄菌株产多糖的特性，计算17株桑黄菌株的总多糖产量。如图5所示，JNSH-15菌株的桑黄总多糖产量最高，达到834.146 mg/L;JNSH-1、JNSH-2、JNSH-8的总多糖产量较高，分别达到665.822、553.897、528.135 mg/L;其他桑黄菌株的总多糖产量较低。

3 结论

不同桑黄菌株类别对活性物质产量有着非常重要的影响。本研究首先进行初始菌株的筛选，从17株不同的桑黄菌株（JNSH-1～JNSH-17）中筛选出1株活性物质总产量最高的菌株。黄酮、多糖作为桑黄药用组成中最为重要、研究得最为系统的2种成分，其产量的高低影响着桑黄的价值[24-25]。因此，本研究选择黄酮、多糖这2种活性物质的产量作为评判桑黄菌株优劣的标准，从而筛选出最优的桑黄菌株。试验结果表明，筛选出的JNSH-15菌株在菌丝干质量、黄酮及多糖产量方面均处于较高水平，综合考虑，将其作为液体发酵生产的最优菌株。

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