外周血细胞因子在慢性乙型肝炎的治疗效果判断的价值研究

隋佳 于梦 朱淑珍 魏青政★

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是一种常见的严重肝脏疾病，每年全球大约有2.4亿人感染HBV，大约有60 万人因此死亡。尽管人类在HBV 的防治方面取得了很大的进展，但HBV感染仍然是慢性肝炎，肝硬化，肝癌的主要原因［1-3］。慢性HBV 感染过程包括免疫耐受期（immune tolerance，IT）、免疫清除期（immune clearance，IC）和非活动病毒携带期（inactive virus carrier，IA），在不同时期患者免疫系统的反应不同，进而表现出不同的临床症状，同时治疗疗效也不一样［4-5］。细胞因子是机体免疫系统发挥功能的重要分子，其产生和作用都离不开免疫系统，在HBV的感染和免疫过程中也扮演着不可替代的作用［6-7］。目前，临床上对慢性乙型肝炎的免疫分期和治疗疗效评价的指标有限，主要依赖乙肝两对半、谷丙转氨酶（Glutamate-pyruvate transaminase，ALT）、乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）等血清学指标，缺乏免疫指标的参与。本研究旨在通过研究细胞因子与ALT、HBV DNA、免疫分期等的相关性，分析外周血细胞因子作为慢性乙型肝炎的疗效评价指标的潜在价值。

1 对象和方法

1.1 病例来源

选取2017年6月至2019年6月于本院传染科门诊就诊的慢性HBV 感染患者75 例为病例来源，所有入组患者均由主治以上医师依据《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》［8］中关于慢性乙型肝炎的诊断标准进行确诊。本实验经医院伦理委员会批准，所有入组病例及家属均对本研究知情并同意。排除标准：①肝癌；②合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎感染者；③合并药物性肝炎、酒精性肝炎、脂肪性肝炎；④合并自身免疫性肝病、系统性自身免疫性疾病；⑤合并妊娠者。

1.2 方法

1.2.1 分组

依据慢性乙型肝炎免疫分期标准［8-9］，将75 例慢性HBV 感染者分为IT 组20 例［HBeAg（+）、ALT＜60 U/L、HBV DNA＞105拷贝/mL］、IC 组30 例［HBeAg（+/-）、ALT＞60 U/L、HBV DNA＞105拷贝/mL］、IA 组25 例［HBeAg（-）、ALT＜60 U/L、HBV DNA＜105拷贝/mL］，同时选择25 例无乙肝病史的健康志愿者为健康对照组。所有组别的性别比例、年龄均无统计学意义，具有可比性。

将上述100 例受试者根据HBV DNA 水平不同分为低病毒载量组（HBV DNA＜105拷贝/mL）、中病毒载量组（105拷贝/mL≤HBV DNA＜106拷贝/mL）、高病毒载量组（HBV DNA＞106拷贝/mL）。再根据血清ALT 水平的不同分为低ALT 组（60 U/L≤ALT＜160 U/L）、中ALT 组（160 U/L≤ALT＜500 U/L）、高ALT 组（ALT≥500 U/L）。

1.2.2 细胞因子和ALT 检测

所有受试者在入组次日早晨空腹采集静脉血4 mL，静置20 min，4 000 r/min 离心2 min、分离血清进行检测，将检测结果根据不同分组进行比较分析。细胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）的检测采用ELISA 法，检测试剂盒均由武汉优尔生商贸有限公司提供。实验步骤严格按照产品说明进行操作；ALT 应用全自动生化分析仪，具体操作步骤参照ALT 测定试剂盒说明书。ALT＞160 U/L 为异常。

1.2.3 血清病毒载量（HBV DNA）检测

分离患者血清，应用Real-time PCR 法检测血清中HBV DNA 载量。乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）由中山大学达安基因股份有限公司提供（单位已经换算成拷贝/mL）。实验步骤参照试剂说明书。HBV DNA＞103拷贝/mL 为异常。

1.2.4 抗病毒治疗

对30 例IC 组患者进行抗病毒治疗1年，药物选用恩替卡韦分散片（江西青峰药业有限公司，国药准字H20100141），剂量为5 mg/d。治疗12 个月后，再次检测ALT、血清病毒载量和细胞因子水平并与治疗前数据进行比较分析

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件包进行统计分析，计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。作图使用Graph-Pad Prism 7。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血HBV DNA 水平与细胞因子的相关性分析

根据不同HBV DNA 水平分组（具体分组方法见1.3），分析不同HBV DNA 水平的慢性HBV 感染患者的外周血细胞因子水平，结果如表1所示。从正常对照组到高病毒载量组，IL-4、IL-6 的变化趋势都是逐渐上升的，随着病毒载量的升高，其表达量也升高，相邻2 个组别间为（P＜0.05），差异具有统计学意义。正常对照组和低病毒载量组血清IL-8 水平为（P＞0.05）差异无统计学意义，但明显低于中病毒载量组（P＜0.05），值得一提的是，高病毒载量组IL-8 水平远高于其他组别（P＜0.05）。IL-17和IFN-γ 的变化趋势较为一致，随着病毒载量的升高而下降，且正常对照与低病毒载量组无显著性差异（P＞0.05），除中高病毒载量组IFN-γ 无显著性差异外，其余各组间均有显著性差异（P＜0.05）。TGF-β 水平也谁病毒载量升高而升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 血清ALT 水平与细胞因子的关系

根据血清ALT 水平分组（具体分组方法见1.3），分析不同血清ALT 水平的慢性HBV 感染患者的外周血细胞因子水平，结果如表2所示。与2.1 中结果类似，IL-4、IL-6 和IL-8 随ALT 水平的升高而升高，低ALT 组（60≤ALT＜160）IL-6 水平较正常对照组（ALT＜60）显著升高外（P＜0.05），低ALT 组IL-4 和IL-8 水平较正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。IL-17、IFN-γ、TGF-β 的变化趋势与2.1 相似，高ALT 组TGF-β 与正常对照组比较有统计学差异（t=2.08，P=0.04＜0.05）。

2.3 慢性HBV 感染过程中不同阶段患者的细胞因子变化

如图1所示，与NC 组比较，IT 期患者血清IL-4、IL-6、IL-8 水平明显升高（P＜0.05），除IA 期IL-8 水平与NC 组无显著性差异外（P＞0.05），其余IC 期和IA 期患者IL-4、IL-6、IL-8 水平均显著低于IT 期和NC 组患者（P＜0.05）。对比IL-17 和IFN-γ 表达可发现，与NC 组比较，IT 期患者IL-17 和IFN-γ 表达显著减少（P＜0.05），但IC 期和IA 期又开始回升，IA 期IL-17 水平甚至与NC 组相当，无统计学差异（P＞0.05）。与NC 组比较，IT 期TGF-β 水平明显升高（P＜0.05），IC 期和IA 期水平略降低，但无统计学差异，且与NC 组也无统计学差异（P＞0.05）。

表1 不同HBV DNA 水平患者细胞因子表达（±s）Table 1 Cytokine expression in patients with different HBV DNA levels（±s）

表1 不同HBV DNA 水平患者细胞因子表达（±s）Table 1 Cytokine expression in patients with different HBV DNA levels（±s）

vs 正常对照组，aP＜0.05；vs 低病毒载量组，bP＜0.05；vs 中病毒载量组cP＜0.05。

组别正常对照组低病毒载量组中病毒载量组高病毒载量组n 35 15 17 33 IL-4（pg/mL）8.5±3.6 18.8±5.1a 34.7±5.4ab 42.2±6.8abc IL-6（pg/mL）28.5±13.2 38.5±15.9a 58.1±17.3ab 70.4±21.3abc IL-8（pg/mL）7.0±2.2 8.6±3.8 12.3±3.7ab 61.1±41.3abc IL-17（pg/mL）154.3±66.3 157.1±46.3 113.5±37.2ab 89.4±31.3abc IFN-γ（pg/mL）31.5±7.1 28.7±5.1 16.4±3.7ab 14.5±4.3ab TGF-β（pg/mL）98.2±46.3 103.2±54.1 111.2±46.5 123.2±62.3

表2 不同ALT 水平患者细胞因子表达（±s）Table 2 Cytokine expression in patients with different ALT levels（±s）

表2 不同ALT 水平患者细胞因子表达（±s）Table 2 Cytokine expression in patients with different ALT levels（±s）

vs 正常对照组，aP＜0.05；vs 低ALT 组，bP＜0.05；vs 中ALT 组cP＜0.05。

组别正常对照组低ALT 组中ALT 组高ALT 组n 70 12 7 11 IL-4（pg/mL）8.6±4.1 10.3±3.2 28.7±4.9ab 54.3±10.9abc IL-6（pg/mL）29.6±11.8 52.5±17.8a 58.1±20.5a 75.4±21.3abc IL-8（pg/mL）7.5±4.2 10.6±3.3 22.4±10.1ab 63.1±38.4abc IL-17（pg/mL）159.3±70.6 153.0±44.5 123.9±40.1ab 74.4±29.6abc IFN-γ（pg/mL）33.2±6.3 25.7±5.8a 15.4±4.7ab 11.5±3.8ab TGF-β（pg/mL）99.4±50.1 105.1±37.8 115.2±45.4 133.2±41.2a

图1 不同感染阶段患者血清细胞因子水平Figure 1 Serum cytokine levels in patients at different stages of infection

2.4 抗病毒治疗前后患者血清各指标变化

收集25 例HBeAg 阳性的慢性乙肝患者，应用替恩卡韦干预治疗12 个月以后采集外周血，检测ALT、HBV DNA、各细胞因子等数据，结果如图2所示。患者ALT 和HBV DNA 水平较治疗前显著降低（P＜0.05）。细胞因子的检查发现，患者治疗后IL-4、IL-6 和IL-8 较治疗前明显降低（P<0.05），IL-17、IFN-γ 较治疗前明显升高（P<0.05），TGF-β无显著性变化（P>0.05）。

3 讨论

HBV 感染在全球特别在发展中国家，是一种严重的公共卫生问题［3］。急性HBV 感染以后，大约1%～5%的成人会发生慢性感染，这种感染的发病率随着年龄的增长而降低，新生儿和儿童的发病要高于成人［10］。慢性乙型肝炎病毒感染是导致患者发病和死亡的重要原因。从HBV 的自然史可以了解到，准确把握慢性HBV 感染分期，对于治疗和预防再发有着重要的意义［11］。目前关于慢性乙型肝炎的治疗效果主要通过ALT，乙肝五项，HBsAg DNA 等角度来评判，但这一判断机制大多从病毒和脏器角度出发，没有深入到免疫层面。细胞因子在机体抗病毒免疫中发挥着重要作用，外周血细胞因子的检测相对容易获得，通过分析外周血细胞因子与ALT、HBsAg DNA 以及慢性HBV 感染分期的关系，有助于深入挖掘细胞因子作为慢性乙型肝炎疗效评价的指标［6］。

图2 抗病毒治疗前后ALT、HBV-DNA 和细胞因子的变化Figure 2 Changes of ALT，HBV-DNA and cytokines before and after antiviral therapy

IL-4 对HBV 基因表达有抑制作用，因此，它在调节病毒基因的表达和肝脏的先天防御机制中起着重要而复杂的作用［12］。关于慢性肝炎患者IL-4水平的报道不尽相同，一些研究报道慢性肝炎患者IL-4 的表达水平降低而一些研究中表明IL-4 水平升高［13-16］。本研究中，IL-4 水平随HBV DNA 水平升高而升高，与血清ALT 水平呈正相关趋势，随HBV 感染过程先升高后下降，抗病毒治疗后水平下降。这些结果提示我们，IL-4 的表达水平与肝脏的炎症和坏死程度密切相关，即患者受到感染后随着疾病的进展，肝脏炎性反应逐渐增加，IL-4的水平也随之波动。与IL-4 变化类似的还有IL-6、IL-8 和TGF-β。IL-6 是一种多效细胞因子，其水平的升高与各种慢性疾病［17］以及慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的发病率和疾病活动有关。本研究中，IL-6 的水平随ALT 水平的升高而升高，也说明了IL-6 可以反应肝脏的炎症情况。TGF-β 与本研究中多个细胞因子有相互作用关系。在慢性乙型肝炎中，肝组织的炎性反应激活肝脏间质细胞表达TGF-β，TGF-β 对Th17 的分化成熟非常重要，它与IL-6 共同作用可以启动CD4+T 细胞向Th17 细胞分化，成熟的Th17 细胞产生IL-17、IL-6 等炎性介质，进一步加强炎性反应。TGF-β 本身具有抗炎作用，本研究中随着ALT 水平的升高而升高，原因可能在于肝脏炎性反应的增强促进了TGF-β 的进一步分泌以减少炎症影响、维持肝脏功能。本研究中涉及到的另外两个细胞因子IL-17 和IFN-γ的表达水平规律类似，随HBV DNA 水平升高而升高、但在高病毒载量时表达水平略有下调，与ALT之间的关系也是如此；在不同的疾病进展过程中，这两种细胞因子水平随疾病进展先降低后升高，在抗病毒治疗后表达水平显著升高。造成这一现象的原因可能是在肝脏受到损伤时，在TGF-β 等细胞因子的作用下，Th17 细胞分化较多，IL-17 水平升高；而当病毒感染较为严重时，总的CD4+ T细胞的数量减少，尽管有细胞因子促进了Th17 细胞的分化但数量仍受到限制，导致IL-17 的分泌有一定程度的下降。IFN-γ 同理。

本研究通过比较不同HBsAg DNA 和ALT 分级的细胞因子（如IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、TGF-β 等）的变化趋势，探究哪些细胞因子可以作为潜在疗效的评价指标。结果显示，除TGF-β 外，其他细胞因子均与HBsAg DNA 和ALT 存在一定的相关性，IL-4、IL-6、IL-8 与HBsAg DNA 和ALT呈正相关，IL-17、IFN-γ 与之呈负相关。然后对比不同慢性HBV 感染分期的细胞因子指标差异，结果显示，除TGF-β 外，其他细胞因子均在不同分期差异显著（P＜0.05）。尤其是IL-8，在IC 期的表达水平明显高于其他时期。最后，本研究选择IC 期30 例进行抗病毒治疗，12 个月以后，检测细胞因子和其他血清学指标发现IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ 同HBsAg DNA 和ALT 一样在治疗前后有显著性变化，TGF-β 在治疗前后变化差异不大。因此，有理由相信，细胞因子可以作为评价慢性乙型肝炎疗效的潜在指标。本研究由于经费和人员的关系，只检测了六种报道与慢性HBV 感染关系较为密切的细胞因子，更多的潜在的细胞因子还需要更深入的研究来发现。此外，通过对细胞因子的深入挖掘，还有利于对慢性HVB 发病机制的研究。由于本研究所选的样本量有限，且年龄因素尚未考虑，还需要更多更深入的研究论证IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ 是否可以作为慢性乙肝治疗效果的评价指标。

综上所述，外周血细胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ 与ALT、HBsAg DNA 及慢性乙肝感染分期都存在一定的相关性，可以作为慢性乙型肝炎治疗的潜在评价指标。