大孔吸附树脂分离核桃青皮萘醌类成分及其抑菌性研究

刘迪，宋晓宇，李婧，尚华，杨建民

1.陕西工业职业技术学院，陕西 咸阳 712000 2.陕西海升果业发展股份有限公司，陕西 西安 710100

核桃青皮(walnut green husk)又称青龙衣，在我国古代就因其具有镇痛、抗菌、消炎、抗肿瘤等多种功效而被入药[1-9]。核桃的果实可食用或被加工成各种核桃产品，食用或加工后的核桃会产生大量的核桃青皮废物，甚至还会污染环境。

为了对核桃青皮再次利用，本研究以核桃青皮中代表性有效成分萘醌为分离对象，采用大孔分离树脂分离响应面试验优化分离参数，同时考察核桃青皮萘醌提取物的抑菌性，为核桃青皮变废为宝提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃青皮粉，购于陕西省宝鸡市，50 ℃烘箱内烘干，粉碎，经0.15 mm孔径的筛孔过滤，装袋封口，0～4 ℃冰箱保存；1,8-二羟基蒽醌标准品(含量>98%)，Sigma-Aldrich公司；乙醇、甲醇、醋酸镁、二氯甲烷三氯化铁、氯化钙、氯化钠、氯化锌、双氧水、亚硫酸钠，均为分析纯；D101树脂，西安蓝晓科技新材料股份有限公司；营养琼脂培养基、蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠、蒸馏水、磷酸盐，均为国产生化试剂或化学试剂；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，由陕西科技大学生命科学与工程学院微生物试验室提供。

1.2 仪器与设备

UV-5300PC型紫外/可见分光光度计：上海元析仪器有限公司； RV8旋转蒸发仪：德国IKA公司；BT100-1L恒流泵：兰格恒流泵有限公司；AL204型电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；无菌工作台：上海瑞宏检测技术有限公司；培养箱，上海立德泰勀科学仪器有限公司；电热手提高压蒸汽消毒锅，成都志能实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制备[10]

将1,8-二羟基蒽醌标准品在105 ℃烘箱内干燥，准确称取0.002 g标准品，用少量60%乙醇溶解，转移至10 mL容量瓶，用60%乙醇定容至10 mL，摇匀，作为标准储备液备用。准确移取标准储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至25 mL比色管中，准确加入1 mL浓度为5%KOH溶液，再用60%乙醇溶液定容至25 mL；准确移取1 mL浓度为5%KOH溶液，用60%乙醇溶液定容至25 mL，作为空白对照。在530 nm下，测定不同浓度溶液的吸光度值，利用线性拟合，得到吸光度(y)与标准品浓度(x)的标准曲线，并得到回归方程。

1.3.2 粗提液的制备

称取一定量核桃青皮粉，按照1∶40(g∶mL)的料液比与60%乙醇混合，放入60 ℃水浴锅中浸提6 h，取出抽滤两次，将滤液合并在50 ℃条件下旋转蒸发浓缩，制备不同浓度的粗提液，作为树脂上柱液使用。

1.3.3 单因素试验和响应面试验

考察吸附液浓度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25%)、吸附液pH值(1、2、3、4、5)和吸附液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min)对核桃青皮萘醌类成分的提取率影响；考察洗脱液浓度(10、85、90、95、100%)、洗脱液pH值(1、2、3、4、5)和洗脱液流速(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL/min)对核桃青皮萘醌类成分的洗脱率影响。选用3因素3水平，利用Box-Behnken中心组合设计原理，设计响应面试验。

1.3.4 萘醌提取物抑菌试验

1.3.4.1 供试液的制备

将核桃青皮粗提液和树脂分离提取物旋转蒸发至浸膏，分别称取0.5 g，用20 mL50%的无菌水丙酮溶液进行溶解，得到浓度为25 mg/mL的原始供试液，将原始供试液依次进行两次梯度稀释，并标记为1#、2#和3#供试液，其浓度分别为25 mg/mL，12.5 mg/mL和6.25 mg/mL。将无菌水丙酮溶液编为0#，作为空白液。

1.3.4.2 抑菌试验

分别吸取大肠杆菌供试菌液和金黄色葡萄球菌供试菌液(细菌浓度>107个/mL)0.1 mL于冷凝好的两个培养基上，用无菌刮铲涂布，平放于无菌台上20～30 min。在培养基平板后面，用记号笔划“+”，将皿底等分成四等分。在涂有大肠杆菌的培养基后面将各区标记D0#、D1#、D2#和D3#，在涂有金黄色葡萄球菌的培养基后面将各区标记P0#、P1#、P2#和P3#。剪取直径为5 mm的圆形滤纸片，分别浸入0#、1#、2#和3#供试液中，将各滤纸片按照编号分别放入各培养皿的4个区内，滤纸片应按照浓度由低到高的顺序放置。每个平板做3个平行。将培养基倒置，置于28 ℃培养箱中培养24 h，记录抑菌圈的大小。抑菌圈大小按照下式计算：

抑菌圈直径=样品菌落直径-空白菌落直径。

1.3.5 数据处理

单因素试验和体外抗氧化性试验数据均用均数±标准差(mean±S.D.)表示；响应面试验数据采用Design-Expert 8.0软件处理和分析；数据显著性分析用t-检验法检验，P<0.05被视为显著性差异，P<0.01被视为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据1.3.1方法，得到萘醌标准曲线如图1所示，标准曲线方程为y=124.38x-1.019，回归系数R2= 0.992 4，能够满足检测需要。

图1 萘醌标准曲线

2.2 核桃青皮萘醌提取工艺优化

2.2.1 树脂吸附单因素试验结果

树脂吸附单因素试验结果如图2所示。结果显示最优吸附条件为吸附液浓度0.10 mg/mL、吸附pH值2、吸附液流速0.5 mL/min。其中，吸附液浓度和吸附液pH值对吸附率影响，均随着单因素数值的增大而呈现先增大后减小的趋势；吸附液流速大，吸附率反而下降。吸附液浓度过小，树脂吸附不饱和，吸附率不高；浓度过大，树脂过饱和，吸附率几乎不再变化。吸附液pH值大小影响树脂吸附效果，过小或过大，均使吸附效果不能达到最大化。吸附液流速变大，树脂来不及及时吸附，从而使吸附率降低。

吸附液浓度 / (mg·mL-1)(a)吸附液浓度对吸附率的影响

吸附液pH值(b)吸附液pH值对吸附率的影响

吸附液流速/ (mL·min-1)(c)吸附液流速对吸附率的影响图2 各因素对吸附率影响

2.2.2 树脂吸附响应面试验结果

响应面试验因素水平设计如表1所示，试验结果如表2、3所示。

表1 树脂吸附响应面试验因素水平

表2 树脂吸附响应面试验结果

表3 树脂吸附响应面试验结果方差分析

注：*表示显著水平(P<0.05)；**表示极显著水平(P<0.01)

各因素的P值大小表明其对结果影响的显著性，P值数据显示，吸附液浓度的影响极显著(P<0.01)，吸附液pH的影响显著(P<0.05)，吸附液浓度二次方的影响极显著(P<0.01)，吸附液pH二次方的影响显著(P<0.05)，各因素之间吸附液浓度和吸附液pH之间的交互作用P值最小。F值显示各因素对结果影响顺序为：吸附液浓度>吸附液pH>吸附流速。

回归分析给出模型的二次回归方程为:

R=-7.95+1 301.6A+18.705B-9.84C+7.00AB+4.00AC-0.60BC-5 748.00A2-4.47B2+5.12C2

此方程对应的最佳提取条件：吸附液浓度0.11 mg/mL，吸附液pH为1.89，吸附流速0.54 mL/min，预测最大吸附率为82.11%。对最佳条件取整为：吸附液浓度0.10 mg/mL，吸附液pH为2，吸附流速0.5 mL/min，确定该条件为最佳实际操作条件，以便于工业化生产。在确定的最佳实际操作条件下平行试验3次，测得到平均吸附率为81.89%。

2.2.3 树脂洗脱单因素试验结果

树脂洗脱单因素试验结果如图3所示。单因素试验结果显示最优洗脱条件为洗脱液浓度96%、洗脱pH值3、洗脱液流速0.5 mL/min。各因素对洗脱率影响，均随着单因素数值增大而呈现先增大后减小趋势。洗脱液浓度和pH 值大小直接影响洗脱液的极性，从而影响洗脱效果。洗脱液流速过小，洗脱液总量小，洗脱效果不佳；洗脱液流速过大，被吸附成分来不及完全被洗脱液带走，洗脱率降低。

洗脱液浓度/%(a)洗脱液浓度对洗脱率的影响

洗脱液pH值(b)洗脱液pH值对洗脱率的影响

洗脱流速/(mL·min-1)(c)洗脱液流速对洗脱率的影响图3 各因素对洗脱率影响

2.2.4 树脂洗脱试验结果

响应面试验因素水平设计如表4所示，试验结果如表5、6所示。

表4 树脂洗脱响应面试验因素水平

表5 树脂洗脱响应面试验结果方差分析

表6 树脂洗脱响应面试验结果

注：*表示显著水平(P<0.05)；**表示极显著水平(P<0.01)。

各因素的P值大小表明其对结果影响的显著性，P值数据显示，洗脱液浓度的影响极显著(P<0.01)，洗脱流速的影响显著(P<0.05)，洗脱液浓度二次方的影响极显著(P<0.01)，洗脱流速二次方的影响显著(P<0.05)，各因素之间洗脱液浓度和洗脱液pH之间的交互作用P值最小。F值显示，各因素对结果影响顺序为：洗脱液浓度> 洗脱流速>吸附液pH。

回归分析给出模型的二次回归方程为：

R=5 528.953 12+117.574 50A+17.147 50B+83.812 50C-0.135 00AB-0.275 00AC+0.625BC-0.619 30A2-0.682 50B2-67.062 50C2

此方程对应的最佳提取条件洗脱液浓度94.45%，洗脱液pH为3.43，洗脱流速0.45 mL/min，预测最大洗脱率为71.77%。对最佳条件取整为：洗脱液浓度95%，洗脱液pH为3.5，洗脱流速0.5 mL/min，确定该条件为最佳实际操作条件，以便于工业化生产。在确定的最佳实际操作条件下平行试验3次，并测得到平均洗脱率为70.63%。

2.3 萘醌提取物抗菌性试验结果

不同浓度提取物抑菌圈的大小如表7所示，同一浓度的提取物对不同菌种的抑菌能力大小如图4和图5所示。不同提取物在浓度为50 mg/mL和25 mg/mL对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出了一定的抑菌能力，而浓度低于25 mg/mL则不可检出抑菌圈，且同一浓度下，树脂分离提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均高于粗提物。

表7 提取物抑菌活性试验结果

图4 提取物对大肠杆菌抑菌效果

图5 提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果

4 结论

试验结果表明，核桃青皮萘醌类成分树脂吸附最优条件为：吸附液浓度0.1 mg/mL、吸附液pH值2、吸附流速0.5 mL/min，在此条件下吸附率可达81.89%，各因素对吸附率影响顺序为：吸附液浓度>吸附液pH>吸附流速；最优洗脱条件为：丙酮洗脱液浓度95%、洗脱液pH值3.5、洗脱流速0.5 mL/min，在此条件下洗脱率可达70.63%。各因素对洗脱率影响顺序为：洗脱液浓度> 洗脱流速>洗脱液pH；抑菌试验表明，提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑制作用，且萘醌树脂分离提取物的抑菌性高于粗提物。