植物乳杆菌活菌片剂产品的功能性与稳定性研究

孙 盛,朱 珺,陈作国,李宝磊,陈 苏,李言郡

(杭州娃哈哈集团有限公司研究院，生物工程研究所,浙江杭州 310018)

目前,国外益生菌产品以食品和膳食补充剂两种类型为主[1],其中,含有益生菌的膳食补充剂以具有功能性宣称的片剂、粉剂和胶囊居多,部分产品也添加了其他功能性成分,如提取物、益生元、发酵副产物及其他生物活性物质等[2]。大部分产品菌株标识清晰,有明确的菌种名和活菌数量。我国益生菌相关领域研究起步较晚,益生菌产品与国外同类产品相比,基础理论、生产技术与行业规范都还比较落后[1],市场上的益生菌产品质量参差不齐[3],产品标识也较为混乱,部分产品缺乏明确的菌株或有效活菌数的标识说明,多数产品只以出厂菌数进行标识。益生菌的益生功效在消费者体内的有效发挥必须依赖于对其充分的功能研究,有效剂量的确定以及在货架期储藏过程中活菌数的维持。产品中的活菌数量不稳定,其功能就会打折扣,严重影响益生菌产品的功效发挥。因此,结合益生菌产品的功能特性与储藏稳定特性开展研究尤为重要。

益生菌和益生元在乳制品、饮料、奶粉、保健食品和饲料等领域都有着广泛应用[4-5],其作为膳食补充剂通过选择性地刺激肠道中定植微生物的生长和代谢,提高肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌含量,从而达到调节肠道菌群平衡,改善功能性便秘的目的[6]。益生元和益生菌联合使用兼具两者的双重功效且能发挥协同效应,从而更好地发挥益生功能。益生元是指一种不易消化的无生命的食物成分,通过调节肠道菌群对宿主健康产生有益作用[7],主要有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、棉子糖等,此外多糖类物质中的抗性淀粉、L-阿拉伯糖、菊粉、乳果糖、葡聚糖等,多元醇类中的甘露醇、木糖醇、山梨醇、乳糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇等也属于益生元[8]。这些益生元功能相同,但因结构、组成、特性不同,在实际应用中需要针对食品特性和益生菌特性来选择最合适的益生元[9]。益生元除了作为肠道微生物营养物质,促进其生长,还能够选择性激活肠道中有益菌的代谢功能,使肠道菌群向有益于宿主健康的方向发展,改善肠道功能[10]。

在前期研究的过程中,我们发现了一株植物乳杆菌,并命名为植物乳杆菌581,它是从四川泡菜中分离得到,经研究发现具有优良的生长特性和产酸特性,能在高pH和胆盐浓度下保持较高活性,黏附性高,并具有改善便秘、润肠通便的功效,可以应用于发酵功能食品中。本研究以植物乳杆菌581为研究对象，通过检测植物乳杆菌581的生长曲线和终点pH评价其对不同益生元的利用效率，采用小鼠便秘模型评估低聚果糖和植物乳杆菌581制成的片剂产品的功效，通过监测产品在4、28 ℃贮存6个月的活菌数、水分含量和水分活度评价产品稳定性，为其应用于益生菌活菌片剂产品开发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌 581 来自娃哈哈菌种保藏中心,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定保藏;远交系昆明SPF级小鼠雄性(体重18～22 g,6～8周龄,SCXK(浙)2018-0003) 购自浙江省杭州杭斯生物科技有限公司;小鼠维持饲料 浙江省杭州杭斯生物科技有限公司;复方地芬诺酯 常州康普药业有限公司;MRS培养基 英国Oxoid生物试剂有限公司;不同益生元来源如表1所示。

表1 不同益生元原料来源Table 1 Sources of different prebiotic raw materials

Baker Type B2 SterilGARD III生物安全柜 美国BAKER公司;Delta 320 pH计 瑞士METTLER TOLEDO公司;DU800型紫外分光光度计 美国Beckman公司;Eppendorf 5810 R型离心机 德国Eppendorf公司;Aqualab 4TE型水分活度仪 美国Decagon AquaLab公司;HR83 Halogen水分含量测定仪 瑞士METTLER TOLEDO公司;HSZP35型高速压片机 上海天峰制药设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 片剂配方中益生元的筛选 配制不同碳源的MRS培养基溶液,121 ℃,15 min高压蒸汽灭菌备用。不同碳源分别包括2%添加量的葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、L-阿拉伯糖、乳果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇。

筛选方法参照张芳[11]的方法,略有改动。将植物乳杆菌581菌株以1%的接种量接种到含有MRS液体培养基的试管中，在37 ℃下培养,于培养的0～10 h每隔2 h取样测定光密度值(OD600),培养10 h时取样测定pH,每个样品三次重复。

1.2.2 片剂制备 植物乳杆菌581经37 ℃发酵16 h,-30 ℃冻干72 h后制成菌粉,采用平板培养法进行活菌计数。将植物乳杆菌581(2×1010CFU/片)、低聚果糖和其他辅料(见表3)混合后,用HSZP35高速压片机(转速15 r/min)制成片剂(2.0 g/片,1.7 mm)。

表2 产品配方表Table 2 Product formulation table

1.2.3 通便功能实验 为了验证含有植物乳杆菌581的产品是否具有润肠通便、缓解便秘的功效,研究采用复方地芬诺酯建立的小鼠便秘模型,参照《保健食品检验与评价技术规范》中相应方法[12]开展通便功能实验。

动物饲养保持环境温度为(21±2) ℃,湿度为30%～70%,12 h光照交替,自由摄入小鼠维持饲料和饮水。昆明小鼠自购入起适应7 d后,按体重进行随机分组,共分为4组,每组12只。分组包括对照组、模型组、益生菌组、片剂产品组。其中,益生菌组灌胃植物乳杆菌581,灌胃剂量为6.67×109CFU/kg小鼠体重。片剂产品组灌胃片剂产品,灌胃剂量为0.67 g/kg小鼠体重(其中所含植物乳杆菌581剂量同益生菌组),相当于人体服用剂量1片/d。对照组和模型组每天灌胃与受试组等体积的0.85%的生理盐水溶液。受试样品给喂7 d后,除对照组外,其余各处理组给予复方地芬诺酯悬液(10 mg/kg小鼠体重),0.5 h后,灌胃墨汁,观察并记录每只小鼠的首粒排黑便时间、6 h内排黑便的粒数及重量。实验期间每7 d对小鼠体重进行检测。

1.2.4 产品的稳定性测定 对压片产品进行贮藏稳定性测试。片剂产品用铝箔袋真空热封包装后,分别放置于4 ℃和室温28 ℃环境下贮存。每月测定压片产品的活菌数、水分含量、水分活度及其他感官指标,连续测定6个月,每个样品三次重复。

1.2.5 产品稳定性指标测定 将压片产品用研钵研碎后,称取1 g溶于9 mL 0.85%生理盐水中,取1 mL依次进行梯度稀释,稀释至10-7,取100 μL于含有固体MRS培养基的平皿进行涂布,放于37 ℃培养箱培养48 h,计数;称取1 g用水分活度仪检测压片产品水分活度;称取0.5 g用水分含量测定仪检测压片产品水分含量。每个样品三次重复。

1.2.6 统计分析 测定指标均表示为“平均值±标准偏差”。显著性分析采用SPSS 17.0软件中的Duncan’s多重比较检验法进行分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌581对不同益生元的利用特性

比较植物乳杆菌581对不同种类益生元的利用特性。由图1可知,植物乳杆菌581对低聚果糖和低聚异麦芽糖的利用效果最好,生长速率最快,其次为甘露醇和低聚半乳糖。L-阿拉伯糖、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇基本不能被植物乳杆菌581有效利用。

图1 不同益生元对植物乳杆菌581生长曲线的影响Fig.1 Effect of different prebiotics on the growth curve of L. plantarum 581

植物乳杆菌581是一株产酸能力较强的乳酸菌。发酵终点的产酸强度同样也反应了菌株的生长情况。由图2可知,植物乳杆菌581对低聚果糖、低聚异麦芽糖、甘露醇的利用效果最好,终点酸度最低,与生长曲线结果基本一致。说明低聚果糖促进植物乳杆菌581生长的能力较优,且经过文献调研低聚果糖具有一定的润肠通便功能[13-15],基于581菌株对不同种类益生元的利用特性及成本等其他因素综合考量,选取低聚果糖作为与581进行配伍的益生元,并完成产品配方制定与压片产品试制。

图2 不同益生元对植物乳杆菌581产酸情况的影响Fig.2 Effect of different prebiotics on the acid production of L. plantarum 581注:标注*表示与葡萄糖相比具有显著性差异,P<0.05; 标注**表示与葡萄糖相比具有显著性差异,P<0.01。

2.2 通便功能实验

由表3可知,各处理组小鼠体重与对照组相比均无显著差异(P>0.05),说明压片产品对小鼠生长状况无影响。

表3 不同处理组小鼠的体重变化情况Table 3 Body weight change of mice in different treatment groups

受试样品给喂7 d后,进行小鼠排便情况测定。由表4可知,与对照组相比,模型组小鼠的首次排黑便时间极显著增加(P<0.01),6 h排黑便粒数和排黑便质量降低(P=0.085,P=0.078),表明采用复方地芬诺酯悬液灌胃制造便秘模型造模成功。

表4 不同处理组小鼠的排便情况Table 4 Defecation of mice in different treatment groups

与模型组相比,灌胃益生菌与灌胃益生菌片剂产品的小鼠首次排黑便时间显著降低(P<0.05,P<0.01),同时6 h排黑便粒数显著增加(P<0.05)。其中,片剂产品组的首次排黑便时间、6 h排黑便粒数和质量三项指标均优于益生菌组。表明采用经过筛选的益生元与益生菌复配产品的功能更优于单独益生菌的使用。

2.3 片剂产品的稳定性跟踪

检测含有植物乳杆菌581与低聚果糖的益生菌片剂产品的稳定性。在0～6个月的储藏期限内,产品的外观、色泽均无明显变化。

产品的水分含量与水分活度在4 ℃与28 ℃贮藏条件下均呈现先减小后增大的趋势(表5)。产品的活菌数在4 ℃贮藏条件下基本无显著变化,始终维持在1×1010CFU/g左右。在28 ℃储藏条件下,活菌数随着贮藏时间的延长而降低,至6个月时活菌数降至103CFU/g(表6)。说明含有植物乳杆菌581的益生菌片剂产品适宜在4 ℃进行贮藏。

表5 0～6月片剂产品水分含量与水分活度的变化情况Table 5 Changes in moisture content and water activity of tablet products of 0～6 months

3 讨论与结论

2011年国际益生菌与益生元研究会对益生元进行较详细的阐述,认为益生元主要特点为不被消化、能被肠道细菌发酵、能选择性地刺激肠道菌群的生长和(或)活性[13]。益生元的种类多样,不同益生元促进菌株生长状况存在差异,本研究发现植物乳杆菌581对低聚果糖的利用率较高。低聚果糖一般由1～3个果糖基通过糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生产的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等的混合物。研究表明,摄入低聚果糖具有一定缓解便秘的作用,但需达到一定有效剂量[14]。王宇[15]研究报道了便秘患者需服用低聚果糖5 g/d,连续7 d后可显著改善排便状况。本研究中低聚果糖服用量相当于1 g/d,远低于有效剂量。

植物乳杆菌581菌株分离自四川泡菜样品,本身具有一定的润肠通便功能。同时,研究发现,片剂产品组小鼠的首次排黑便时间、6 h排黑便粒数、6 h排黑便质量均优于同等菌浓度的益生菌组,表明低聚果糖能够促进植物乳杆菌581更好的发挥润肠通便功能,功能效果更优于单独益生菌的使用。

对于益生菌类片剂产品而言,保证其功能性的关键是在货架期内保证其足够的活菌菌数。FAO与WHO将益生菌定义为“当摄入足够量时对宿主能发挥有益功效的一类活的微生物”,其中也强调了活菌的概念[16]。目前,由于国家相关法规的缺乏或不健全,市售的部分益生菌类产品仅以出厂时活菌数进行标示,不能保证储藏标识条件下货架期内的活菌数;或既缺乏有效剂量的标识,也无法保证货架期内可否达到有效剂量。因此,本研究在完成产品功能性评价的同时,对产品的稳定性也进行了研究。

益生菌片剂产品的水分含量,尤其水分活度对产品的稳定性有一定的影响。产品中包含的水可分为自由水与结合水,其中自由水一般指细胞内、细胞间可自由流动、参与物质代谢并为微生物所利用的水,由水分活度表征[17]。本研究对6个月储藏期内产品的水分含量与水分活度变化进行了追踪实验,其中产品的水分活度在0.20～0.26之间,期间呈现先降低后增高的趋势。研究同时发现,在28 ℃贮藏条件下,产品活菌数随着贮藏周期呈明显下降趋势。Lone等[18]针对嗜酸乳杆菌(LA-5)在不同水活度条件下(Aw=0.11、0.22、0.32、0.43)进行3个月的稳定性跟踪,实验结果显示,随水活度的降低菌粉产品的稳定性明显提高。Satu等[19]报道了鼠李糖乳杆菌LGG在Aw=0.22条件下储藏14个月活菌数下降约3.5个数量级,而在Aw=0.11条件下菌数基本无显著变化。与现有文献报道相比较,可以通过降低片剂产品水分活度来增加产品的稳定性。此外,片剂类益生菌产品不同于粉剂产品,其在压片过程中形成的压力对菌粉的活力保持存在影响也可能是本研究中产品活菌数降低的原因之一[20-21]。后续研究将考虑从多方面进行改善,包括优化辅料筛选,降低产品水分活度,优化压片工艺,添加压力缓冲类辅料[22]或优化产品包装工艺与包装材质等,提高货架期内产品的稳定性。

本研究表明,植物乳杆菌581可利用低聚果糖作为碳源来源,在多种益生元中应用效果最优。以此为依据选择低聚果糖为主要配方成分,经动物实验研究表明,与植物乳杆菌581在体内可发挥协同作用。以人体服用量为1片/d的剂量进行动物实验研究,结果表明该片剂产品对小鼠的首次排黑便时间、6 h排黑便粒数和质量均有显著改善的效果,具有良好的润肠通便的功能。本款产品在4 ℃储存可保证其活菌数与优良的功能性。