姜黄素对神经胶质瘤细胞的抑制作用及机制研究

王泽夏，封 烨，刘 菲，余良主，李敏才△，胡美纯

(1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100；2.信阳农林学院，河南信阳 464006)

胶质瘤是一种常见的原发性脑肿瘤，包括星形细胞瘤、少突胶质瘤和室管膜瘤。多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是所有肿瘤中最具侵袭性的实体瘤之一，预后极差。分化不良的GBM具有细胞形态多样性、核异型性、核分裂活跃，组织学特征表现为坏死、血管增生和血栓形成等形态学特征[1]。目前的治疗方式有肿瘤切除、化疗、放疗及抗血管类靶向药物治疗等；由于GBM的特殊性，寻找新的治疗方法或更好的药物具重要意义。姜黄素[1,7-二(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，Curcumin]是从姜黄属植物粉末状根茎中分离得到的一种天然多酚类化合物[2]，这种化合物对人类疾病，如炎症性疾病和神经退行性疾病具有积极的治疗作用[3-4]。有研究表明，姜黄素对肝癌、乳腺癌具有抑制增殖、调节信号通路等多种作用[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，又称Akt，参与细胞存活、细胞周期调节和细胞增殖生长等多种生物学作用[5]。Akt受到外部信号刺激时，磷酸化Akt(p-Akt)与许多底物的相互作用体现其调节功能。有文献报道姜黄素能通过调节Akt促进卵巢癌细胞的凋亡[6]。Akt功能还受到其他因素的拮抗作用，如人第10号染色体缺失磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin nomolog deleted on chromosome ten,PTEN)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)和同源盒结构基因(homeobox gene，HOX)B9的调节[7]。PTEN是抑癌基因，PTEN蛋白可以抑制Akt及其下游激酶的活性，从而抑制肿瘤生长和促进凋亡[8]。姜黄素在GBM中的研究报道较少，本研究探讨姜黄素对GBM的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，进一步揭示对Akt及相关蛋白的调节机制，以为姜黄素临床药理作用提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1材料 人胶质母细胞瘤U251细胞株为研究模型。主要相关试剂：姜黄素购自美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)高糖培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素购自美国Gbico公司；Matrigel胶购自美国Corning公司；Hoechst细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物科技公司；Akt抗体(C67E7)购自美国CST公司；p-Akt抗体(bsm-33281M)购置北京博奥森生物技术有限公司；PTEN抗体(D3Q6G)购自美国CST公司；GAPDH抗体(sc-32233)购自美国Santa Ctuz公司；Akt抑制剂(Quercetin)购自美国Selleck公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胶质母细胞瘤U251细胞培养于5%CO2、37 ℃培养箱内。培养基为高糖DMEM含10% FBS和1%青霉素-链霉素，待细胞长满至90%时进行传代，取细胞对数期进行实验。

1.2.2MTT增殖实验 将U251细胞消化后调整细胞密度至8×104个/mL，按每孔100 μL加至96孔板中并放置培养箱中培养过夜。吸去原培养基，加入DMEM高糖培养基100 μL，设6个姜黄素浓度[0(对照组)、5、10、20、30、40 μmol/L]，每个浓度设5个复孔，放入培养箱使药物分别作用24、48、72 h。作用时间结束后将细胞板取出，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，放置培养箱4 h后取出。吸去96孔板中的液体，每孔加入DMSO 150 μL，室温反应15 min后放置酶标仪中，使用490 nm进行吸光度(OD)的测定。细胞存活率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值，设定对照组存活率为1。

1.2.3细胞划痕实验 消化后U251细胞铺至6孔板内培养，待细胞融合至90%～95%时，使用黄枪头轻轻地在6孔板底部划一条线。弃去原培养液，分别加入含0(对照组)、10、20 μmol/L的姜黄素培养液，放置培养箱12 h后，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)润洗2次，4%多聚甲醛固定10 min后拍照。细胞迁移率=(初始细胞间隙-实验组细胞间隙)/(初始细胞间隙-对照组细胞间隙)，设定对照组迁移率为1。

1.2.4细胞黏附实验 在冰上将Matrigel胶与DMEM培养基按1∶2比例混合后按每孔30 μL加至96孔板相应位置中，放置培养箱内1 h。用10 μmol/L姜黄素浓度预作用24 h后调整细胞密度为1.5×105个/mL，每孔加入100 μL,每组设3个复孔。将96孔板放置培养箱90 min后取出，去培养基PBS润洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色5～6 min，PBS洗去多余结晶紫。每组拍照结果进行细胞计数，细胞黏附率=姜黄素组细胞数/对照组细胞数。设定对照组黏附率为1。

1.2.5细胞侵袭实验 在冰上将Matrigel胶与DMEM按1∶2比例混合后按每孔30 μL加至Transwell小室中，同24孔板一起放置培养箱1 h，取出后将未凝固的Matrigel胶吸走。将事先饥饿24 h的细胞消化后并调整细胞密度为6×105个/mL。设3个姜黄素浓度组[0(对照组)、10、20 μmol/L]，每组做3个平行组。上室加入100 μL细胞和100 μL含相应药物浓度的DMEM无血清培养基。下室加入相对应药物浓度的含血清DMEM培养基。放置培养箱培养24 h后，取出弃去培养基，4%多聚甲醛固定10 min，用棉签轻轻擦去未穿过Matrigel胶的细胞，0.1%结晶紫染色5 min，PBS洗去多余结晶紫，待干燥后拍照。每组拍照结果进行细胞计数。细胞侵袭率=实验组细胞数/对照组细胞数。设定对照组侵袭率为1。

1.2.6细胞Annexin V-FITC/PI双染凋亡实验 将无菌的细胞爬片提前放置在24孔板内，把消化的细胞调整密度至3.5×105个/mL，以每孔500 μL加入至24孔板中过夜。弃除培养基，加入分别含0(对照组)、10、20 μmol/L的姜黄素培养基并放置培养箱培养24 h。取出后弃除培养基，PBS润洗2遍后加入Hoechst染色液染色5 min；PBS润洗2次，每孔加入400 μL Annexin V结合液，再加入5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液，混匀，避光室温反应10 min，PBS润洗2次。取出爬片，将有细胞面的爬片贴于含有抗荧光淬灭剂的载玻片上，将载玻片置于正置荧光显微镜上，使用UV激发光拍摄Hoechst染色的细胞(细胞核)；使用Blue激发光拍摄Annexin V染色的细胞(早期凋亡)；使用Green激发光拍摄PI染色细胞(晚期凋亡或坏死)。

1.2.7Western blot实验 将10 μmol/L姜黄素及20 μmol/L Akt抑制剂(Quercetin)作用24 h的细胞取出置于冰上。配制裂解液工作液[加强型放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、磷酸化蛋白酶抑制剂、Cocktail]。用PBS润洗细胞2次，吸去多余PBS；加入适量裂解液工作液静置10 min使其细胞充分裂解，使用细胞刮刀刮下后再静置5 min；将细胞转移至离心管中离心(12 000 r/min，4 ℃，15 min)，取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白水平并定量；加入相对应体积的5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) Loading buffer置于100 ℃水浴锅中煮沸7 min。按照配方制备凝胶，并再每孔加入等体积样品，并保证每孔蛋白不低于50 μg；使用80 V电泳至分离胶后改120 V电泳至底部。将预先在甲醛浸泡10 min的聚偏氟乙烯(PVDF)膜按照相应顺序放置转膜夹内进行转膜(270 mA，70 min)。使用5%脱脂牛奶封闭1 h；将PVDF按条带大小裁剪后放入对应一抗内4 ℃过夜，TBST润洗3次，每次10 min；放置对应种属二抗室温孵育1 h后TBST润洗3次，每次10 min后显影。

2 结 果

2.1姜黄素抑制神经胶质瘤细胞增殖 通过观察姜黄素对U251细胞增殖的影响，在刺激时间相同的条件下，随着姜黄素刺激浓度升高，U251细胞增殖活性下调；在姜黄素刺激浓度相同的条件下，作用时间越长，U251细胞增殖活性越下降明显，见图1。本研究认为10 μmol/L姜黄素刺激24 h为理想实验刺激条件。

2.2姜黄素抑制神经胶质瘤细胞迁移 不同浓度的姜黄素刺激后，对U251细胞迁移能力均有明显的抑制作用。与对照组比较，给药组的U251细胞迁移能力呈下降趋势，其中10 μmol/L姜黄素刺激下，细胞迁移能力降低至76.54%；20 μmol/L姜黄素刺激下，细胞迁移能力降至37.61%，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各组细胞划痕图像，见图2。

2.3姜黄素减弱神经胶质瘤细胞黏附 与对照组比较，在姜黄素刺激下，U251细胞黏附能力减弱，见图3AB。姜黄素组黏附的数量为(207.97±15.68)个，明显低于对照组的(299.12±38.40)个；姜黄素组胶质瘤细胞黏附能力下降至68.60%，见图3。

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较

图1姜黄素对U251细胞增殖的影响(n=3)

A ：初始划痕图像；B：对照组细胞迁移12 h后；C:姜黄素10 μmol/L组细胞迁移12 h后；D:姜素素20 μmol/L组细胞迁移12 h后

图2各组细胞划痕图像(×100)

A ：对照组;B:姜黄素组；C：两组细胞黏附能力比较；a：P<0.05，与对照组比较

图3对照组与姜黄素组神经胶质细胞结晶紫染色(×100)及细胞黏附能力比较(n=3)

A:对照组；B:姜黄素10 μmol/L组；C：姜黄素20 μmol/L组；D:各组胶质瘤细胞侵袭能力比较；a：P<0.01，与对照组比较

图4各组神经胶质细胞结晶紫染色(×100)及细胞侵袭能力比较 (n=3)

图5 各组细胞荧光显微镜下Annexin V-FITC/PI 双染结果(×100)

1：对照组；2：姜黄素组；3：Akt抑制剂组；4：姜黄素+Akt抑制剂组；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较

图6各组U251细胞中PTEN、Akt、p-Akt蛋白表达水平比较(n=3)

2.4姜黄素下调神经胶质瘤细胞侵袭能力 在不同浓度姜黄素刺激后，U251细胞侵袭能力呈下调趋势，Transwell实验结果显示，10 μmol/L姜黄素组侵袭转移的细胞数量为(110.43±15.08)个，明显低于对照组的(165.13±20.07)个；当姜黄素浓度达到20 μmol/L时，侵袭转移的细胞数量为(65.57±5.36)个，胶质瘤细胞的侵袭能力明显下调至41.00%，见图4。

2.5姜黄素促进神经胶质瘤细胞凋亡 随着姜黄素浓度升高，Annexin V-FITC染色阳性细胞及PI染色阳性细胞均逐渐增加，提示胶质瘤细胞凋亡和死亡数量增多。与对照组(4.29%)比较，姜黄素10、20 μmol/L组U251细胞凋亡率(18.99%、32.17%)明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。各组细胞荧光显微镜下Annexin V-FITC/PI双染结果，见图5。

2.6姜黄素对胶质瘤细胞Akt和PTEN蛋白表达的影响 与对照组比较，姜黄素组U251细胞Akt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图6A、B；与对照组相比，姜黄素组U251细胞p-Akt/Akt表达明显下调(P<0.05)，见图6A、C。给予Akt抑制剂(Quercetin)刺激作用后，与对照组比较，U251细胞Akt、p-Akt/Akt明显下调(P<0.05)，见图6A、B、C。在姜黄素与Quercetin共同刺激下，与对照组比较，U251细胞Akt、p-Akt/Akt表达呈明显下调趋势(P<0.05)，见图6A、B、C。在姜黄素处理的U251细胞，与对照组比较， PTEN蛋白表达明显提高(P<0.01)，见图6D。

3 讨 论

肿瘤细胞迁移是肿瘤侵袭性的重要表现之一，肿瘤细胞的黏附能力是肿瘤转移重要的生物学特征，肿瘤细胞的侵袭性是良恶性肿瘤的重要标志。本研究探讨姜黄素对胶质瘤细胞U251作用研究，发现姜黄素对胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等方面有明显性抑制作用，并检测到p-Akt、PTEN蛋白水平表达变化，揭示姜黄素通过这些相关蛋白调节作用机制影响GBM的生物学行为，胶质瘤作为颅内最常见的原发性肿瘤，病死率极高，其治疗显得特别重要。目前基本治疗手段是手术加放疗，由于肿瘤浸润性生长方式、放射性损伤周围正常脑组织的特点，导致治疗效果差。 自从2005年美国食品和药品管理局(FDA)批准了口服烷基化剂替莫唑胺(TMZ)治疗GBM以来，TMZ被认为是GBM的一线化疗剂[9]，其分子机制是TMZ诱导DNA烷基化、形成交联，触发细胞凋亡。TMZ治疗缺点是在脑肿瘤内会产生耐药性[10]。FDA批准的另一种治疗GBM药物是贝伐单抗，是人源化的抗VEGF-A单克隆抗体。VEGF促进血管生成，可上调VEGF信号转导通路[11]。贝伐单抗通过抑制胶质瘤血管生成、下调VEGF信号通路起到治疗作用。有研究发现贝伐单抗与静脉血栓栓塞、出血和胃肠穿孔等不良反应有关[12]。大多数抗GBM治疗药物涉及单一靶点的调节[13]，开发新的多靶点、更安全的抗GBM药物具有重要意义。

中药成分姜黄素来源广泛，在中国传统食物如生姜等食物含量成分很大。二酮类化合物姜黄素具有抗炎、抗氧化、降脂等作用，广泛应用于慢性疾病治疗。临床研究表明，姜黄素单独或与其他药物合用，对癌症患者具有良好的抗癌效果：姜黄素和紫杉醇协同作用可以抑制乳腺癌细胞的生长[14]；姜黄素能增强顺铂、依托泊苷和喜树碱对癌细胞的损伤作用[15-16]。说明姜黄素对不同类型肿瘤细胞效应作用存在一定的分子靶点。ZHANG等[17]报道姜黄素制剂能穿过小鼠的血脑屏障，这对姜黄素在治疗颅内疾病方面提供了实验依据，为姜黄素对胶质瘤的治疗提供了极大的可能性。

恶性肿瘤细胞属性是无限的增殖与浸润性生长，肿瘤细胞凋亡是影响肿瘤生长的重要因素。本研究发现姜黄素可明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，具有抗肿瘤作用，证明了姜黄素除能对除实体瘤以外的肿瘤也具有抗肿瘤作用。本研究还表明姜黄素能明显促进GBM细胞凋亡的作用，也是对姜黄素抑制胶质瘤细胞增殖的解释之一。

Akt/p-Akt是细胞增殖与信号调节通路的重要分子，Akt是信号传导途径中重要的蛋白激酶，p-Akt是Akt激活的主要机制，介导多种生物学效应。姜黄素通过联合甘草次酸下调PI3K/Akt/PTEN信号通路的活化，从而抑制肝癌细胞生长[18]；姜黄素能通过Akt/PTEN/FOXO4通路诱导p53基因表达缺失的肝癌细胞株Hep3B凋亡[19]。这些研究表明，姜黄素可以通过Akt/PTEN通路有效的抑制恶性肿瘤细胞增殖。本研究中姜黄素对总Akt表达没有明显的影响，对p-Akt表达有明显下调作用；发现姜黄素与Akt抑制剂(Quercetin)有明显的协同效应。本研究认为姜黄素可通过p-Akt/Akt活性调节GBM增殖、侵袭与迁移。

PTEN是肿瘤组织中的抑癌基因，PTEN蛋白的沉默促进肿瘤发生。PTEN蛋白是具有脂质和蛋白磷酸酯酶活性的双特异性磷酸酯酶，对肿瘤增殖、迁移有抑制作用。本研究发现姜黄素能上调胶质瘤细胞中PTEN表达，对胶质瘤细胞的发挥抑制作用。LEE等[20]报道PI3K/Akt活性调节诱导PTEN泛素化促进肿瘤形成，在本研究中姜黄素下调了p-Akt活性、抑制PTEN泛素化作用，上调PTEN表达从而抑制胶质瘤的形成。因此本研究解释了姜黄素通过下调Akt/PTEN通路抑制胶质瘤细胞增殖。

姜黄素对GBM作用可能有更多的分子靶点参与其中，如姜黄素促进胶质瘤细胞凋亡的分子机制需要进一步研究；本研究中姜黄素对GBM作用的实验数据，需要在动物体内的研究证明，是本课题进一步研究的重点。本研究重要意义是天然药物姜黄素对GBM治疗提供实验和理论依据，可为能通过血脑屏障的抗GBM新药研发工作提供资料。