日本龟蜡蚧肠道微生物多样性分析

郝文英，张艳峰，谢映平

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

日本龟蜡蚧（Ceroplastes japonicus Green）属半翅目蚧科蜡蚧属，在我国分布范围广泛，危害多种林木和果树，是一种种群聚集性的害虫。在昆虫的整个生命过程中，肠道微生物是影响其生长发育和新陈代谢的重要元素之一[1-3]。按肠道微生物与宿主昆虫间的利弊关系可以分为益生菌、病原菌、条件致病菌[4]。刺吸式昆虫靠吸食植物韧皮部汁液存活，但研究表明，植物汁液中的营养物质单一且不均衡缺少昆虫生长发育所必需的营养物质[5]。DOUGLAS[6-7]利用抗生素和含同位素的营养液饲喂的方法研究证明，Buchnera 可以为宿主蚜虫提供多种必需氨基酸。ZAKEE 等[8-9]通过对Uzinura 的基因组分析表明，肠道微生物Uzinura 可以为盾蚧提供必需氨基酸。

本试验利用高通量测序技术对日本龟蜡蚧肠道细菌的16S rDNA 序列进行测序分析，得到日本龟蜡蚧肠道的优势菌群，通过抗生素处理肠道菌群结构预测肠道微生物对宿主营养代谢的影响，旨在为日本龟腊蚧综合控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

蚧虫于2018 年4 月采自稷山县日本龟蜡蚧发生严重的柿树和枣树上，采样时将日本龟蜡蚧寄生的树枝一同剪下带回实验室短期饲养，4 ℃保存。

1.2 试剂及仪器

1.3 试验方法

1.3.1 肠道微生物多样性分析 在无菌环境下，将日本龟蜡蚧的蜡壳剥离收集，反复漂洗后在显微解剖镜下解剖出消化道，置于1.5 mL 离心管中。切碎消化道组织，按照DNeasyRBlood&Tissue Kit 试剂盒提取肠道总DNA。在Thermo NANODROP 2000中检测质量浓度为5～20 μg/μL，于-80 ℃冰箱中保存寄样。

1.3.2 抗生素处理 用电子天平称取卡那霉素、氨苄青霉素、利福平各15 mg，分别溶于无菌水中，按1∶1∶1 的比例混合，制成复合抗生素溶液。将带有日本龟蜡蚧的树枝浸泡在复合抗生素溶液中，定期地在叶子上喷洒抗生素溶液，对照组喷洒无菌水，重复3 次。

1.3.3 共生菌多样性分析 基于Illumina HiSeq 测序平台，利用双末端测序的方法，通过构建小片段文库来测序。通过对Reads 拼接过滤，OTUs 聚类，可以揭示样品的物种构成；16S 功能基因预测分析是使用PICRUSt 软件通过比对16S 测序数据获得的物种组成信息，得到不同分组之间的功能差异。

2 结果与分析

2.1 OTU 分析

OTU 即分类操作单元，结合OTU 所代表的物种根据不同的分组绘制Venn 图，表示样品之间共有和特有的OTU 数目[10]。图1 中不同颜色代表不同样本，椭圆形之间重合部分的数字为样品之间共有的OTU 个数。日本龟腊蚧在同一龄期不同寄主下处理前后共有菌为319 种，其中，柿树对照组特有菌为401 种，柿树处理组特有菌为365 种；枣树对照组特有菌为448 种，枣树处理组特有菌为381 种。

2.2 物种丰度比例分析

分别从门、纲、目、科、属水平探究不同寄主以及经抗生素处理后细菌丰度的变化。门水平各组样品中，日本龟蜡蚧肠道微生物中优势菌为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes），共占到总菌门数的80%以上；纲水平各组样品中，日本龟蜡蚧肠道微生物优势菌纲为梭菌纲（Clostridia）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、γ- 变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α- 变形菌纲（Alphaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli），共占到总菌纲数的69%～70%；目水平各样品中，日本龟蜡蚧肠道微生物优势菌目为梭菌目（Clostridiales）和拟杆菌目（Bacteroidales），共占到总菌目数的33%～35%；科水平各样品中，日本龟蜡蚧肠道微生物优势菌科为拟杆菌科（Bacteroidaceae）、韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae），共占到总菌科数的33%～36%。

在属水平上，寄主为枣树和柿树的日本龟蜡蚧肠道微生物优势菌属为拟杆菌属（Bacteroides）、韦荣氏球菌属（Veillonella）、乳杆菌属（Lactobacillus）。用抗生素处理后，寄主为枣树的日本龟蜡蚧肠道微生物中优势菌没有明显变化；寄主为柿树的日本龟蜡蚧肠道微生物优势菌拟杆菌属由15.07%下降至10.08%、韦荣氏球菌属由10.32%下降至5.61%、布赫纳氏菌属由0.16%上升至0.21%（表1）。

表1 属水平日本龟蜡蚧主要共生菌所占比例 %

2.3 16S 功能基因预测分析

KEGG 功能预测是通过KEGG 代谢途径的差异分析，观测不同分组的样品之间微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异和变化，是研究群落样本为适应环境变化发生代谢功能改变的有效手段。

日本龟蜡蚧经抗生素处理后，其糖类代谢、甘氨酸生物合成和代谢及脂类代谢均显著下降，表明肠道菌群能够促进动物营养的代谢和吸收。

3 结论与讨论

本试验通过高通量测序分析细菌16S rDNA 可变区，得出日本龟蜡蚧肠道微生物的优势菌群，以及经抗生素处理后日本龟蜡蚧肠道微生物菌群结构的变化，从而推测肠道微生物与代谢途径的关系。有研究表明，昆虫内肠道微生物参与了宿主大多数的生命活动，对宿主的适应性有很大作用[11-12]；肠道内微生物还能为宿主提供食物中缺乏的营养物质并参与能量代谢等，间接提高宿主的防御能力[13-14]。LIANG 等[15]研究表明，在家蚕的幼虫体内，变形菌门和拟杆菌门属于优势菌群，分别占总菌门数的31%和40%。在日本龟蜡蚧中优势菌门为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，经抗生素处理后，优势菌门种类没有明显发生变化。

日本龟蜡蚧优势菌纲为拟杆菌纲、梭菌纲、α-变形菌纲和γ- 变形菌纲。HONGOH 等[16]研究表明，生活在土壤中的蛴螬，其肠道优势菌群也为梭菌纲（Clostridia）。研究表明，α- 变形菌纲中的沃尔巴克氏菌在肠道微生物中占有很大的比例，沃尔巴克氏体参与了昆虫生殖调控过程[17-19]。HONGOH 等[20]研究发现，白蚁中有一种Bacteroides 属的细菌共生体CfPT1-2，该共生菌含有合成氨基酸和辅酶因子的功能基因。本研究表明，日本龟蜡蚧肠道微生物处理组与对照组的拟杆菌属丰度也存在显著差异，而在16S 功能基因分析中发现，辅因子代谢在处理前后有显著变化。因此，推测拟杆菌属参与了枣树日本龟蜡蚧辅因子的代谢途径。

综上分析，经过多样性检测及KEGG 功能预测，营养代谢的变化可能与对照组中的特有菌有关，其具体参与过程有待进一步研究，研究结果对日本龟蜡蚧的防治具有一定的参考意义。