基于高通量测序技术的玉米不同生育时期土壤细菌多样性变化

李 丹，靳鲲鹏，李小霞，韩文清，曹晋军，刘永忠，李万星

（山西省农业科学院谷子研究所，山西长治046011）

土壤微生物的种类繁多、数量庞大，是土壤生态系统的重要组成部分[1-3]。土壤细菌通过参与土壤有机质的分解、腐殖质合成和养分循环等物质循环和能量流动过程，从而影响着植物的生长发育[4-6]。结构合理、循环良好的土壤生态系统是保证玉米高产、稳产的前提，而关于玉米生长过程中细菌群落结构变化的研究较少。

传统研究土壤微生物的方法存在一定的局限性，如平板计数法就忽略了不可培养微生物、扩大了生长速度等问题，使得研究微生物多样性及群落结构成为一个难题。随着高通量测序技术的发展，其凭借耗时少、通量高、能较为准确地反映微生物在土壤中的群落分布等优势，使微生物研究更为深入[7]。

本试验采用高通量测序技术测定玉米4 个关键生育时期细菌的多样性，从而了解玉米不同生长期细菌的群落特点及变化规律，旨在为玉米高产、稳产创造健康的土壤环境，为后续的科学施肥、土壤质量的评价提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于山西省农业科学院谷子研究所内试验田。该试验田土壤类型为壤土，前茬作物为玉米。

1.2 试验材料采集

于玉米苗期（SG1）、大口期（SG2）、抽雄期（SG3）和成熟期（SG4）随机采集0～20 cm 表层土壤，每个时期取10 个点混合，混合均匀后过2 mm筛，处理好的样品分成2 份，一份寄送到北京百迈克生物科技有限公司（http：//www.biomarker.com.cn/）进行微生物多样性测序；另一份包入无菌锡箔纸放入液氮中速冻，随后带回实验室放入-80 ℃保存备用。

1.3 试验方法

委托北京百迈客生物科技有限公司对土壤样品进行总DNA 的提取、纯化并构建玉米不同生育期土壤细菌的cDNA 文库；然后利用双端测序的方法对土壤细菌的16S rRNA V3＋V4 区进行Illumina（Hiseq 2500 高通量测序技术）测序。

1.4 测序数据分析

使用FLASH v1.2.7、Trimmomatic v0.33、UCHIME v4.2 等软件，对每个样品的原始序列进行拼接、过滤以及去除嵌合体，最终得到有效数据。

使用QIIME[8]（version 1.8.0）软件中的UCLUST[9]对Tags 在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU；并基于Silva（细菌）分类学数据库对OTU 进行分类学注释，并统计各生育时期的群落组成。

使用Mothur 1.30 软件对细菌多样性指数进行评估。

2 结果与分析

2.1 测序与序列组装

经Illumina 测序，共获得640 139 条测序片段，通过双端拼接、过滤后，共产生496 774 条有效序列。在97%的相似度水平下进行聚类分析，结果共获得3 976 个OTU。稀释曲线（Rarefaction curve）是用来验证各样本测序数据量是否充分以及数据量是否能够反映样品中的多样性。本试验4 组样品的稀释曲线均逐渐趋于平缓（图1），说明样品基本合理，能够较真实地反映土壤样本中的细菌群落。

2.2 不同生育时期土壤细菌Alpha 多样性分析

Alpha 多样性（Alpha diversity）有多种衡量指标，即Chao1 指数、Ace 指数、Shannon 指数、Simpson 指数，能够反映单个样品物种丰度及物种多样性。其中，Chao1 指数和Ace 指数是衡量物种丰度即物种数量的多少；Shannon 和Simpson 指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响，Shannon 指数越大，Simpson 指数越小，说明样品的物种多样性越高[10]。覆盖率越高，表明样本中物种被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。

表1 不同生育时期土壤细菌群落多样性指数比较

随着玉米生长发育的进程，细菌的丰度和多样性随之变化。细菌丰度表现为SG3＞SG1＞SG2＞SG4，多样性表现为SG1＞SG2＞SG3＞SG4。SG4 时期细菌Ace 指数、Chao1 指数、Shannon 指数均最小，Simpson 指数最大，说明在收获期土壤丰度最低，多样性最小；SG3 时期细菌Ace、Chao1 指数均最大，说明在抽雄期土壤丰度最大；SG1 时期Simpson指数最小，Shannon 最大，说明在苗期多样性最大（表1）。

2.3 不同生育时期土壤细菌群落组成分析

将OTU 所代表的序列与微生物参考数据库进行比对，得到每个OTU 对应的物种分类信息，进而在各水平统计各样品群落组成。在玉米不同生育时期的土壤中分别检测到42，37，39，37 个细菌门，128，119，126，120 个细菌纲，333，312，331，310 个细菌科和514，487，510，478 个细菌属。

创新律师顾问服务形式。泰安市人大常委会共组建1个律师顾问团和8个律师顾问小组。律师顾问团由5名律师组成，为市人代会会议期间代表履职提供驻会法律服务。组建的8个律师顾问小组分别为全国人大代表、省人大代表和6个县（市、区）人大代表履职服务律师顾问小组，每个团组设两名联系人员，分别由市县两级人大常委会和司法行政机关工作人员担任。人大代表需要法律服务时，可以从公布的律师顾问小组中自由选取律师，也可以通过联系人随机选取律师。常委会明确了律师顾问服务的性质和服务期限，服务属于公益性活动，不收取任何费用；服务期限与人大代表任职期限相同。

门分类水平下，玉米不同生育时期的土壤中检测到的细菌门数分别为42，37，39，37 个。其中，丰度排名较高的前10 个门分别为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bcateroidetes）、芽单胞杆菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和螺旋体菌门（Saccharibacteria）（图2）。

在玉米4 个关键生育时期的土壤中，变形菌门是该土壤微生物的优势类群，约占所发现微生物总数的31%，其次依次是酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、芽单胞杆菌门，其余4 个门丰度较低，均小于5%。

属分类水平下，玉米不同生育时期的土壤中检测到的细菌纲数分别为128，119，126，120 个。其中，丰度排名较高的前10 个属的种类分别是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonadaceae）、芽单胞杆菌属（Gemmatimonadaceae）、Subgroup-6、H16、噬纤维细菌属（Cytophagaceae）、黄单胞菌属（Xanthomonadales）、厌氧绳菌属（Anaerolineaceae）、Gaiellales、RB41（图3）；未知种类细菌占据很大比例。

通过Python 语言工具对样品进行层次聚类（图4-A），用于判断各样品间物种组成的相似性；各样品属水平的丰度柱状图（图4-B），用以判断各样品间物种丰度的相似性。2 个样品越靠近，枝长越短，说明2 个样品的物种组成越相似。4 个样品中，SG1和SG3 距离最近，说明这2 个时期的土壤中微生物的组成最相似，与SG4 的距离最远，说明SG4 与其他样品组成差异最大。

3 结论与讨论

门分类水平下，4 个样品中变形菌门是绝对优势细菌，其次是酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和芽单胞杆菌门。这与前人研究结果一致。JANGID 等[11]在不同类型的耕作土壤中发现，变形菌门占有绝对优势。袁红朝等[12]对稻田的土壤细菌进行了研究，结果发现，变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门是稻田的土壤优势细菌。其次是放线菌门。刘欣等[13]对大豆不同生育期根际土壤细菌群落研究发现，变形菌门、放线菌门、酸杆菌门是大豆根际的优势菌门，但是绿弯菌门含量较少。而本研究中，绿弯菌门含量较多，且其余菌群比例与在以往研究中菌群比例也不相同，这可能与植物的种类、所处地理因素引起的多样性、与植物的营养关系等因素有关。其中，酸杆菌可降解植物病残体多聚物，参与铁循环，具有光合和反硝化能力[14]，对稳定生态系统发挥着重要作用[15-16]；放线菌可参与土壤结构的形成，土壤中有机质的转化，植物生长素和抗生素的分泌[17]；绿弯菌是活性污泥的组成成分之一[18]，有利于降解土壤中的有毒物质，在营养较低环境中适宜生长[19]；硝化螺旋菌作为硝化作用第一阶段的细菌，可将氨氧转化成亚硝酸。单胞菌门适合在环境干燥的土壤中生存[20]；变形菌门、浮霉菌门、放线菌门和硝化螺旋菌门喜好营养丰富的土壤环境；还有绝大多数细菌未能进行分类、培养，其生物学功能不明确，后续需加强对其研究。

在玉米的整个生育期进程中，土壤中细菌多样性随着时间的变化而变化。细菌丰度由大到小排序为SG3＞SG1＞SG2＞SG4，多样性由大到小为SG1＞SG2＞SG3＞SG4。细菌丰度在抽雄期最大，其次依次是苗期、大口期，最后是成熟期。细菌多样性在苗期最大，然后依次递减，在成熟期最小。说明在玉米发育过程中，随着温度、水分、营养等因素的变化，一些适应环境的细菌数量增加，不适应环境的细菌数量在减少。在苗期，温度适宜，土壤营养最为丰富，使得细菌多样性最大；在成熟期，温度降低，营养减少，使得土壤细菌多样性与丰度最低；在大口期，适宜生长的细菌大量繁殖，使得丰度上升。

本研究运用高通量测序技术探究玉米4 个不同关键生育时期土壤细菌群落结构变化，通过分析4 个不同生育时期的土壤可知，苗期多样性指数最高，成熟期最低，表明玉米的生育时期对土壤细菌群落结构有一定影响。本研究为更深入了解玉米细菌群落结构多样性及群落结构的变化提供了理论依据。