不同蛋白源饲料对克氏原螯虾生长及胰岛素生长因子受体基因表达的影响

杨长庚，苏富强，文 华，刘 伟，魏开金

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223；2.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，属十足目爬行亚目蜊蛄科螯虾亚科原螯虾属，原产中、南美洲和墨西哥东北部地区[1]。由于其肉质鲜嫩、营养丰富，且近年来“小龙虾(克氏原螯虾)经济”在全国逐渐兴起，集约化和规模化养殖也随之不断发展，目前已成为我国一个重要的水产经济品种。然而，对于克氏原螯虾营养学的研究起步较晚，相关报道较少。

蛋白质作为重要的物质基础，其对动物体的生长及代谢起重要作用。尤其在水产养殖中，蛋白质是决定水产动物生长快慢的关键因素[2]，水产动物对饲料蛋白质水平要求较高，一般为畜禽的2～4倍，通常占配方的25%～50%，甚至更多。所以，蛋白质需求一直是水产饲料营养研究的热点。鱼粉营养全面，适口性好，抗营养因子少，易于消化，一直以来是水产饲料中不可或缺的优质蛋白源。但是，随着集约化养殖的迅猛发展，鱼粉的需求量急剧上升，其价格一直居高不下。因此，人们对其他多种蛋白源在水产饲料中的开发及应用进行了一系列研究。例如，Elharoun等[3]对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，喷雾干燥后的鸡血粉和急骤干燥后的牛血粉对虹鳟的增重率和饲料效率等有较好的效果。Guillaume等[4]研究结果表明大豆浓缩蛋白替代75%的鱼粉对军曹鱼(Rachycentroncanadum)幼鱼的生长无不良影响。然而，不同蛋白源生物特性、营养价值、养殖效果、价格等差异巨大，造成不同配方饲料的经济性，实际效益差异也很大。因此，寻找既具高营养价值又经济的蛋白源成为配合饲料研究中的必要环节。

目前，对于克氏原螯虾的蛋白质需求已有一些研究报道，研究表明克氏螯虾饵料蛋白质含量为27%～33%较适合[5-7]。克氏原螯虾作为杂食动物，许多种蛋白源均在其饲料配方中有一定的应用[8-9]。然而，对于不同种类蛋白源对克氏原螯虾生长性能、营养生理等的影响未见报道。此外，虾、蟹等甲壳动物必须进行周期型蜕皮才能成长，蜕皮是其生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终[10]。因此如何使小龙虾快速沉积蛋白质是解决肌肉不饱满的关键。大量的研究表明配合饲料中蛋白来源是影响水产动物蛋白质沉积的一个重要因素[11-12]。受到自然环境的限制小龙虾的食性以植食性为主[13-14]，但对动物性原料的消化亦较高[15]。

因此，本实验拟从克氏原螯虾摄食、生长、体组成、脱壳率、成活率以及生长轴基因表达变化等方面，分析不同蛋白源(肉骨粉、菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉)对克氏原螯虾营养生理的影响。以期减少高价动物蛋白源的用量，降低配方成本，为克氏原螯虾饲料科学经济的配制提供理论依据，为推动克氏原螯虾养殖业进一步发展提供重要基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用克氏原螯虾购自荆州市荆州区太湖镇，平均体重10 g左右，体质健康。试验在长江水产研究所中华鲟养殖基地进行。

1.2 实验饲料

试验分别以不同比例的鱼粉、菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉和肉骨粉为蛋白质原料，添加相同水平的棉粕、豆粕制成5种等氮等能的粉状饲料。饲料组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎过80目筛，逐级混匀后加水搅拌，用小型绞肉机制成粒径为2 mm的颗粒，低温烘干并放入-20 ℃冰箱中保存。

表1 试验饲料组成及营养水平

续表

注：每千克复合维生素中含β-胡萝卜素 96 mg，VD312 mg，VE 200 mg，VK340 mg，VB140 mg，VB280 mg，烟酰胺 400 mg，泛酸钙 600 mg，VB6120 mg，B120.8 mg，叶酸 8 mg，生物素 4 mg，VC 200 mg，肌醇 4 000 mg，氯化胆碱 6 000 mg，对氨基苯甲酸 10 mg。

每千克复合矿物质中含KAl(SO4)21.59 g，CaCO3181.01 g，Ca(H2PO4)2，CoCl20.7 g，MgSO452.16 g，MnSO4·H20 0.7 g，KCl 165.53 g，KI 0.14 g，ZnSO41.92 g，NaH2PO4136.05 g，Na2SeO30.06 g，CuSO4·5H2O 0.75 g，FeC6H5O7·5H2O 13.38 g。

1.3 实验设计及饲养管理

用商品料驯化克氏原螯虾1周。然后挑选大小均一、体格健壮的克氏原螯虾幼虾，将其分为5组，分别为对照组、菜籽粕组、发酵豆粕组、鸡肉粉组、肉骨粉组,每组设3个重复，每个重复15尾虾，随机分配于15个(直径2 m、高1 m)养殖桶中，分别投喂不同的试验饲料。每日投喂2次(09∶00；18∶00)，投喂量为体质量的4%～6%，试验水体处于微流状态，溶解氧(DO)≥5 mg/L，pH 7.6±0.1，水温控制在(24±1)℃，试验共进行6周。

1.4 样品采集

试验结束后，禁食24 h，称取每组虾的终末体重,并统计成活率。每桶随机取3尾虾在冰盘上解剖，取肝脏及肌肉置于液氮中保存,用于相关酶活性及基因表达分析，取去壳肌肉于-20 ℃冰箱中保存，用于肌肉常规组成分析。

1.5 样品分析

1.5.1 生长性能分析

试验完成后，按照以下公式计算成活率(SR)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)。

SR=(Mt/M0)×100%

WGR= [(Wt-Wo)/Wo]×100%

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%

式中，Mt表示实验结束时虾存活数尾数，M0表示实验开始时虾存活数尾数；Wt表示终末体质量，W0表示初始体质量；t表示饲养天数。

1.5.2 肌肉营养成分分析

取其肌肉组织用于测定蛋白质(GB/T 5009.5—2003)、水分(GB/T 5009.3—2003)和粗脂肪(GB/T 5009.6—2003)[16]。

1.5.3 肝胰脏消化酶分析

取肝胰脏0.2 g左右加9倍质量的双蒸水冰浴中匀浆制备粗酶液。用福林-酚法测定蛋白酶活性，蛋白酶活力单位定义：在37 ℃下，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸作为一个酶活力单位(U)。用淀粉-碘比色法测定淀粉酶活性，淀粉酶活力单位定义：在37 ℃、30 min内，每毫克蛋白能完全水解淀粉10 mg称为一个淀粉酶活力单位(U)。采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定脂肪酶活性。酶液蛋白含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。酶活力以比活力(U/mg prot)表示，酶的比活力=酶活力/蛋白含量。

1.6 RNA的提取及cDNA合成

将保存在液氮中的肝脏和肌肉组织于液氮中研磨成粉末。使用Trizol reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，按照提取说明操作提取总RNA。按照FastKing RT Kit(With gDNase)(北京天根生化科技有限公司)操作说明，合成cDNA第一链。

1.7 胰岛素生长因子受体(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R)基因克隆及表达分析

根据GenBank中编号MG557703的克氏原螯虾IGF1R序列，设计引物PC-F-S2，PC-F-A2对胰岛素生长因子受体基因进行荧光定量PCR分析其表达情况。其中以18S RNA作为内参[17]，引物序列见表2，引物由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

表2 荧光定量PCR检测所用引物

用TRIzol Reagent 提取总RNA 后， 选择ABS比值在1.8～2.0，3条电泳条带完整清晰的RNA进行反转录(每个样本取500 ng 总RNA)，以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR的反应体系：在20 μL的Quantitative real-time PCR反应混合液中含模板1 μL，上游和下游引物各0.6 μL。反应条件：95 ℃ 3 min 预变性，然后95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 25 s，40个循环，在75～95 ℃进行熔解曲线检测。反应在QIAGEN Rotor-GeneQ 6000实时荧光定量PCR仪上进行。采样检测15个样本，每个样本3个重复。试验所涉及的试剂盒均购自北京TIANGEN公司。

1.8 数据统计

目的基因mRNA相对表达丰度采用2-△△CT法进行分析，以克氏原螯虾18S RNA为内参，对得到的各样品CT值进行均一化处理，以投喂鱼粉为蛋白质原料的饲料的目的基因 mRNA丰度为基准。

1.9 数据处理

试验结果用平均值±标准差(mean±SD)表示，采用Duncan氏多重比较法分析试验结果平均数的差异显著性，差异显著水平为P<0.05，所有数据均采用SPSS19.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾生长的影响

从表3可见，试验进行6周后，各组克氏原螯虾的成活率没有显著性差异。发酵豆粕组的增重率最高，其次是对照组和鸡肉粉组，发酵豆粕组显著高于菜籽粕组和肉骨粉组。对于特定生长率，发酵豆粕组、鸡肉粉组和对照组无显著差异，菜籽粕组显著低于其他各组。

表3 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾生长的影响

注：同列数值后不同上标字母表示差异显著(P<0.05)，表4同。

2.2 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾肌肉营养成分的影响

由表4可见，不同蛋白源饲料对克氏原螯虾水分和粗脂肪无显著性影响；对照组的粗蛋白含量最高，显著高于菜籽粕组和鸡肉粉组，但与发酵豆粕组和肉骨粉组没有显著性差异。

表4 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾肌肉营养成分的影响

2.3 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾肝胰脏消化酶的影响

从图1可见，发酵豆粕组的肝胰脏蛋白酶活性最高，显著高于菜籽粕和鸡肉粉组，发酵豆粕、肉骨粉组和对照组之间差异不显著，菜籽粕组肝胰脏蛋白酶活性显著性低于对照组，其蛋白酶活性最低。肝胰脏淀粉酶活性最高的是肉骨粉组，显著性高于对照组，发酵豆粕组和菜籽粕组肝胰脏的淀粉酶活性显著低于对照组。肝胰脏脂肪酶活性最高的是发酵豆粕组，但各组间没有显著性差异。

图1 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾肝脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性影响的比较Fig.1 Comparison of total liver protease,amylase and lipase activities of P.clarkii fed the diets containing various protein sourcesa:蛋白酶；b: 淀粉酶；c: 脂肪酶注：图上标有不同字母表示差异显著(P<0.05)，图2同。

2.4 胰岛素生长因子受体基因IGF1R的克隆及表达分析

如图2所示，在肌肉IGF1R mRNA相对表达量上，发酵豆粕组的表达量最高，与对照组差异性不显著，但显著高于其他实验组；在肝脏IGF1R mRNA表达上，各试验组相对表达量都显著高于对照组，菜籽粕组、发酵豆粕组和肉骨粉组间相对表达量差异性不显著。

图2 不同蛋白源饲料对克氏原螯虾肌肉及肝脏中IGF1R相对表达量的比较Fig.2 Comparison in muscle and liver relative expression of IGF1R mRNA of P.clarkii fed the diets containing various protein sourcesa:肌肉;b: 肝脏

3 讨论

本试验分析了不同蛋白源(菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉、肉骨粉)对克氏原螯虾营养生理的影响。发酵豆粕是利用微生物在可控条件下降解豆粕，去除抗营养因子，将豆粕中蛋白降解成小肽，同时产生一些微生物的代谢产物，改善其可利用性。有研究表明：发酵豆粕替代饲料中6%的鱼粉，不影响凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的生长和饲料利用[18]。此外，海鲈(Lateolabraxjaponicus)饲料中，发酵豆粕可以替代25%的鱼粉[1]。许氏平鮋(Sebastesschlegeli)饲料中，发酵豆粕可以替代40%的鱼粉[19]。本试验中利用发酵豆粕替代50%鱼粉，经过6周的养殖实验后，发现有利于克氏原螯虾的生长。

菜籽粕是一种重要的植物蛋白源，其具有蛋白含量高(32%以上)，氨基酸组成相对平衡等优点，在我国来源广泛，在水产饲料中具有极大的应用潜力。目前，对菜籽粕对水产动物生长、生理生化的影响以及替代鱼粉等方面，已有一定的研究，发现菜籽粕可以替代部分鱼粉，而对水产动物生长性能影响不大[20-21]。本试验发现菜籽粕替代50%鱼粉，降低了克氏原螯虾的生长。可能是由于菜籽粕含有多种毒素、抗营养因子和较高粗纤维含量，导致克氏原螯虾消化减弱，进而影响了生长。

鸡肉粉和肉骨粉作为动物蛋白源，广泛应用于鱼饲料中以部分替代鱼粉，目前已有许多研究。鸡肉粉可替代黑海菱鲆(Scophthalmusmaeoticus)25%的饲料鱼粉，生长性能没有显著降低[22]。大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)饲料中，肉骨粉替代45%的鱼粉，对大黄鱼生长的影响不显著[23]。本试验结果显示鸡肉粉或肉骨粉替代50%鱼粉，克氏原螯虾的生长性能没有显著性降低。

随着配合饲料的推广应用，在实际生产中经常会遇到的克氏原螯虾生长速度快但尾部肌肉不饱满的问题。推测应该是小龙虾的脱壳周期变短，蛋白质沉积不够的问题造成的。本实验中，在对克氏原螯虾肌肉营养成分分析后，发现水分和粗脂肪没有差异；而粗蛋白有显著性差异，都低于对照组。这可能由于鱼粉相比于其他动物性或植物性蛋白源，它的蛋白质含量高，氨基酸组成平衡及抗营养因子少，更有利于鱼类的营养需求。敬婷等[24]在研究罗非鱼(Oreochromisniloticus)饲料中肉骨粉替代鱼粉实验中发现，通过添加包膜赖氨酸、蛋氨酸来平衡肉骨粉替代组中的赖氨酸、蛋氨酸含量，可能是替代后没有影响罗非鱼生长性能的一个重要因素。

消化酶活力的高低决定了鱼类对营养物质的消化吸收能力，影响其生长速度。而饵料是引起消化酶变化的一个重要因素，其种类和质量不仅影响消化酶的活性、种类、分布，而且还可影响酶的分泌，鱼类能适应于不同的饲料而调整消化酶的分泌。例如，孙盛明等[25]研究发现青鱼专用配合饲料中豆粕和菜粕蛋白替代鱼粉蛋白超过50%对青鱼肠和肝胰脏的蛋白酶活力有显著的影响，而豆粕和菜籽粕替代鱼粉25%、替代鱼粉50%和对照组差异不显著。而本试验发现，发酵豆粕替代50%鱼粉组的肝胰脏蛋白酶活性略高于对照组，但差异不显著，这可能与豆粕发酵处理后，去除一些抗营养因子后更有利于虾体对蛋白质的吸收与利用；菜籽粕替代50%鱼粉组显著低于对照组，可能由于菜籽粕中含有多种毒素和抗营养因子如硫代葡萄糖甙、芥酸、植酸、单宁等，鱼类食用后随时会分解为硫氰酸盐、异硫氰酸盐(ITC)、恶唑烷硫酮(OZT)、腈等有毒物，其中腈化物主要损害肝脏和肾脏[26]，可能由此损害了肝胰脏导致蛋白酶活性分泌的减弱。试验还发现鸡肉粉和肉骨粉替代50%鱼粉后，蛋白酶活性影响不显著，这与动物性蛋白相比植物性蛋白更利于虾体的吸收有关。

饲料中蛋白质种类及含量、脂肪种类及含量对鱼类肠道淀粉酶活性影响不显著[27]，而饲料中淀粉含量对其影响显著。由于本试验淀粉酶活性存在差异，主要是由于饲料中淀粉含量不同而导致的。对于脂肪酶的活性，其主要受饲料脂肪含量的影响，而本试验中各组饲料脂肪水平保持一致，所以脂肪酶活性没有显著性差异。

本试验在对胰岛素生长因子受体基因IGF1R进行克隆后，对其在肌肉和肝脏中的表达情况进行了检测。胰岛素样生长因子1(IGF1)是一种多功能细胞调控因子，它的结构特征为其促生长和物质代谢功能提供依据[28]。而胰岛素生长因子受体基因起着介导胰岛素样生长因子的作用，在调节细胞的增殖和机体的正常发育中具有重要作用。Gricourt等[29]运用人类重组蛋白IGFR研究了长牡蛎(Crassostreagigas)IGF通路，认为在长牡蛎体内也具有一条IGF-IGFR通路，在该通路中，IGF发挥了促进生长的功能。宋姗姗等[30]阐述了胰岛素样生长因子Ⅰ受体结构、功能及其与生长发育的关系。本研究中结果显示该基因在小肠和肝脏中均有表达，且在肝脏中表达量较高。发酵豆粕组在小肠和肝脏中都出现比较高的表达，而此组的克氏原螯虾生长最好，说明该基因的表达量与克氏原螯虾的生长有密切的联系。