肿瘤新抗原疫苗的研究进展①

于金玉 孔 燕 郭 军

(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所肾癌黑色素瘤内科,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142)

肿瘤免疫治疗(Cancer immunotherapy)是利用自身免疫系统对恶性肿瘤细胞进行特异性杀伤，并尽可能地降低对正常组织的副作用。肿瘤免疫治疗是继化疗和靶向治疗后最具前景的肿瘤治疗方法之一[1]。近年来，免疫检查点(Immune checkpoint)抑制剂已在临床上显示出免疫治疗的优势，在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等肿瘤中均表现出持久的抗肿瘤效果以及良好的耐受性[2-5]，但其有效率仍不能满足当前肿瘤治疗的需求。因此，未来的免疫疗法需要联合多种治疗策略。

肿瘤的免疫编辑(Immune editing)是一个动态的过程。肿瘤的发生经过了3个连续的阶段，即免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸[6]。即使在免疫逃逸阶段，肿瘤仍然可以刺激机体产生免疫反应。肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen)是在肿瘤细胞中表达升高的抗原分子，其在正常细胞中也有一定的表达[7]。因此，肿瘤相关抗原在机体内会发生中枢耐受，即针对肿瘤相关抗原的特异性T细胞会在胸腺中被清除。例如，基于肿瘤相关抗原黑色素瘤相关抗原A3(Melanoma-associated antigen-A3，MAGE-A3)研发的抗肿瘤疫苗在黑色素瘤和肺癌中并没有提高总生存率[8]，这与中枢耐受导致的T细胞反应弱有很大关系。

肿瘤新抗原(Neoantigen)存在于各种肿瘤中[9]，它可以成为T细胞特异性攻击的靶点，从而杀死肿瘤细胞[10-13]。在免疫检查点抑制剂治疗过程中，新抗原是激活的T细胞攻击的靶点[14-16]。近年来，针对肿瘤新抗原疫苗的研究逐渐显示出了新抗原疫苗优势。在这篇综述中，我们系统描述了肿瘤新抗原疫苗的研究进展。

1 肿瘤新抗原

肿瘤相关抗原是在正常组织中也存在的蛋白，但是在肿瘤中表达升高，也被称为是“自身”抗原，例如癌睾丸抗原家族。肿瘤新抗原是由体细胞基因突变产生的。例如，非同义点突变、插入缺失突变、移码突变、基因融合等可产生肿瘤新抗原。因此，肿瘤新抗原也叫肿瘤特异性抗原或“非自身”抗原。突变是癌症的一个普遍特征，每种肿瘤可以有成百上千个编码基因突变[17]。在二代测序普及之前，就有研究发现肿瘤新抗原可以被免疫系统识别和靶向。例如，Parmiani等[9]用自体肿瘤特异性T细胞从外周血和肿瘤中对新抗原进行了体外识别。与肿瘤相关抗原相比，肿瘤新抗原作为免疫治疗的靶点主要优势包括无中枢耐受、与主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)分子亲和力强、降低了正常组织的脱靶副反应、安全性高等。大多数针对肿瘤相关抗原的临床试验都没有表现出与标准治疗相比更好的获益[18]。Sahin等[19]发现接种新抗原表位与肿瘤相关抗原的患者相比，新抗原表位引起的免疫反应更强。但以往鉴定的新型肿瘤抗原有限。近年来，靶向新抗原治疗的关注越来越多。随着二代测序技术与生物信息学技术的发展，大规模全基因组测序将不同癌症的突变谱展现出来[20-24]。新一代测序技术的发展实现了肿瘤和正常体细胞基因组序列的快速对比，这为快速、低成本寻找个体新抗原提供了有利条件[25]。

2 肿瘤新抗原疫苗

肿瘤新抗原疫苗的目标是通过给予机体新抗原的刺激，使机体产生足够强的免疫反应清除肿瘤细胞。可以将新抗原以合成长多肽(Synthetic long peptide,SLY)、RNA、激活的树突细胞(Dendritic cell,DC)及DNA等形式转入患者体内。在体内新抗原表位可与MHCⅠ结合激活CD8+T淋巴细胞使其分化为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)，发挥细胞毒作用；或与MHCⅡ结合激活CD4+T淋巴细胞，使其分化为辅助性T细胞(Helper T cell)，如Th1和Th2细胞，分别与巨噬细胞和B淋巴细胞相互作用。

制备新型肿瘤抗原疫苗首先要筛选出具有免疫原性的新抗原。Karasaki等[26]对比了现有数据库和个体化检测方法筛选新抗原的效果，发现个体化检测的筛选效率要明显强于数据库筛选。 此外，大量的证据也证实肿瘤的个体间存在着显著的异质性[27]。因此，虽然利用现有的数据库筛选新抗原方便、快速、低成本，但是并不能满足新抗原筛选的需求，新抗原的筛选还是要以个体化的检测为基础。

一个体细胞突变是否可以成为一个新抗原通常取决于以下因素：①体细胞突变是否在蛋白质水平表达；②突变表达的蛋白是否可以加工成适合的多肽；③多肽与患者自身的人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)分子的亲和力；④突变肽/HLA复合体与T细胞受体的亲和力。全基因组或外显子测序得到的许多体细胞突变并没有表达(例如非编码突变、无义突变或单等位基因表达等)。只有成功转录并翻译的突变才有可能被加工成短肽片段，与HLA分子结合提呈于细胞表面，以得到免疫系统的识别。人工合成时，突变的氨基酸通常位于多肽的中间位置。在所有癌症基因组中，单核苷酸突变引起的非同义突变最有可能表达并被免疫系统识别[28]。而且，具有免疫原性的新抗原并不一定是表达水平高或者突变频率高的基因，新抗原免疫原性的强弱与突变是否导致功能的改变也无关[29]。目前新抗原疫苗制备的流程大致为(图1)：①患者肿瘤组织和正常体细胞行基因组或全外显子测序；②肿瘤组织转录组测序；③预测和/或检测突变的多肽与患者HLA的结合力；④合成相应类型疫苗。Cherryholmes等[30]总结了所有的MHCⅠ和MHCⅡ结合预测工具，目前大多数应用以基因序列为基础的预测工具，少数以结构为基础。常用的MHC结合预测工具有NetMHCIIPan、免疫表位数据库(Immune epitope database，IEDB)、SYFPEITHI等[29，31，32]。Rubinsteyn等[33]研发了综合基因组、转录组测序结果的个体化基因组疫苗(Personalized genomic vaccine，PGV)评分体系。质谱技术中也可以用来筛选与肿瘤MHC分子结合的新抗原[34-36]。目前已报道的新抗原疫苗类型有合成长多肽疫苗、RNA疫苗、DC疫苗等，不同类型的疫苗在生产、存储及安全性方面有着不同的优劣势(表1)。肿瘤新抗原疫苗的给药方式有皮下给药、腹膜内给药、淋巴结内给药以及血管内给药[14，29，36-39]。

3 肿瘤新抗原疫苗的研究

目前已报道的新抗原疫苗有SLP、RNA和DC疫苗。SLP新抗原疫苗易于生产和存储且安全性高、毒性低，目前研究最为广泛。该类疫苗的临床前和早期临床研究已经在结肠癌、肉瘤、乳腺癌及黑色素瘤中开展，而且在早期临床研究中展现了明显的抗肿瘤优势。RNA和DC疫苗制备相对复杂，研究相对于SLP较少，但这两类疫苗均有早期临床研究开展。RNA新抗原疫苗也在早期临床研究中表现出有效的抗肿瘤作用，DC新抗原疫苗已被证实可诱导机体对新抗原产生免疫反应，但其抗肿瘤效果还有待进一步研究。

图1 新抗原疫苗制备流程Fig.1 Manufacture of neoantigen vaccineNote: WGS.Whole genome sequencing；WES.Whole exome sequencing.

3.1SLP疫苗 SLP长度为8～30个氨基酸不等，通常将突变位点的氨基酸置于多肽的中间位置，并常以poly(I∶C)为佐剂。近期研究显示，SLP在临床前动物实验与早期临床试验中均显示出了显著的抗肿瘤效果。

肿瘤新抗原SLP疫苗临床前研究最为广泛。异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate dehydrogenase type 1,IDH1)的单等位点突变常发生于早期胶质瘤以及其他肿瘤中[40-45]。Schumacher等[32]通过体外MHC结合实验证实IDH1(R132H)可以和MHCⅡ分子结合激活T细胞，而相应的野生型IDH1则无法激活T细胞。将IDH1(R132H)的SLP疫苗接种于小鼠体内可诱导产生对抗IDH1(R132H)抗体，并且具有抗肿瘤生长的作用。虽然此项研究是利用现有数据库的突变位点，没有进行个体化设计，但是它证实了新抗原疫苗可以激活体内的免疫系统，产生抗肿瘤作用。Castle等[29]通过小鼠荷瘤实验发现新抗原驱动蛋白家族成员18B(Kinesin family member 18B，KIF18B)(K739N)和裂解和聚腺苷酸化特异性因子3样蛋白(Cleavage and polyadenylation specific factor 3-like，CPSF3L)的疫苗在小鼠的肿瘤预防与治疗上都有明显的效果，并且进一步研究发现,95%参加免疫反应的T淋巴细胞都为CD4+T淋巴细胞[45]。该团队建立了肿瘤新抗原SLP疫苗的初步流程，也揭示了CD4+T细胞在肿瘤新抗原疫苗中的重要作用，提示预测新抗原与MHCⅡ分子结合在开发新抗原疫苗中有着重要的地位。Gubin等[14]在小鼠肉瘤模型中发现了两个新抗原，即层黏连蛋白α亚单位4(Laminin subunit alpha-4，LAMA4)(G1254V)和天冬酰胺连接糖基化8(Asparagine-linked glycosylation 8，ALG8)(A506T)，是抗PD-1治疗的免疫反应抗原。联合接种这两个突变抗原表位的SLP不仅对肿瘤有预防作用，而且抗肿瘤效果与免疫检查点抑制剂相当，其效果优于单个SLP的疫苗。这项研究提示靶向多个新抗原的疫苗可以有更显著的抗肿瘤作用，新抗原疫苗与免疫检查点抑制剂联用或许可以使更多的抗原暴露，获得更好的抗肿瘤效果。Yadav等[36]利用外显子组测序、转录组测序和质谱分析等方法筛选出两种小鼠肿瘤细胞中有免疫原性的新抗原，发现大量突变未能与MHC结合表达于细胞表面，提示多肽合成以后传递至内质网后的过程是决定其能否成为新抗原的重要因素之一。此外，质谱技术有可能成为一个过滤无效突变和筛选新抗原的有效方法，但其灵敏性和特异性还需进一步提高。 Martin等[46]将预测到的小鼠卵巢癌细胞ID8-G7的新抗原SLP接种于小鼠体内发现，不论是预防性还是治疗性研究，小鼠的总生存期均未见延长。卵巢癌是一种突变率相对较低的肿瘤，Martin等认为其突变数量不足以筛选出有效的新抗原。但是此项研究只分析了与MHCⅠ亲和力强的新抗原，CD4+T淋巴细胞也在新抗原疫苗中发挥着重要作用，或许预测并分析对MHCⅡ亲和强的新抗原可以增加其成功率。

表1 不同类型新抗原疫苗特点比较

Tab.1 Comparison of different types of neoantigen vaccine characteristics

Vaccine typeAdvantagesDisadvantagesSLP vaccineEasy for production and storage;low toxicity and safe;capable of activa-ting both CD8+ and CD4+T cell;easy for repeated vaccination.Require of adjuvant;multiple antigens combination need to be synthesized respectively.RNA vaccineNo integration into the genome;expression of different epitopes at same time.Complex production;easy degradation.DC vaccineCapable of activating naïve T cell;capable of activating innate and ac-quired immunity;capable of expression different antigen and adjuvant in a single vaccine.Complex production and high cost;short half-life.

人源肿瘤异种移植(Patient-derived xenograft，PDX)模型技术的发展使得动物疾病模型保留了患者疾病的组织型和遗传特征[47]。Zhang等[37]利用3名进展期乳腺癌患者的PDX模型，通过计算分析和体外合成肽亲和力实验，筛选出与MHCⅠ亲和力强的新抗原SLP，使之诱导分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并将PBMC回输，其中1名患者环形导向受体3(Rounda-bout guidance receptor 3，ROBO3)(A1287V)和乳腺癌易感基因2伴随与定位基因(Partner and localizer of breast cancer susceptibility gene 2，PALB2)(H198D)的新抗原SLP可抑制肿瘤生长。两项基于该研究的三阴性乳腺癌临床研究正在进行中(NCT02348320和NCT02427581)。

SLP疫苗在临床研究中也初见成效。Ott等[31]开展的一项Ⅰ期临床研究，共入组了6名高复发风险的恶性黑色素瘤术后患者(Ⅲ期或Ⅳ期)，预测每位患者新抗原与HLA-Ⅰ类分子结合的能力并排序，给6名患者接种了SLP疫苗。在接种疫苗后20～32个月的随访中，4名Ⅲ期患者均没有出现复发，两名Ⅳ期患者出现了复发，但均在抗PD-1抗体治疗后获得完全缓解。该研究尽管是预测的新抗原与HLA-Ⅰ的结合力，但是实际上激活HLA-Ⅱ的抗原比例要远高于HLA-Ⅰ，这再一次说明新抗原疫苗不仅可以激活CD8+T细胞，也可激活CD4+T细胞。这项临床研究也成功地证实了肿瘤新抗原疫苗在临床应用中安全性高、可行性强，具有十分好的应用前景。此外，SLY疫苗在胰腺癌临床研究中也表现出十分好的抗肿瘤复发作用[48]。

3.2RNA疫苗 由于RNA疫苗不插入基因组，安全性好，表达纯度高也有着良好的应用前景。肿瘤新抗原RNA疫苗在临床前与早期临床研究中也显示出了明显的抗肿瘤潜力。Kreiter等[38]通过比较不同的给药路径(淋巴结内、淋巴结周围、皮下、皮内)发现，编码抗原的裸RNA直接淋巴结内注射具有较高的生物利用度，可选择性地被DC摄取，有效地引起抗原特异性T细胞免疫反应。在淋巴瘤和黑色素瘤荷瘤的小鼠体内，HA和SIINFEKL RNA疫苗分别对两种肿瘤起到保护性和治疗性的抗肿瘤免疫反应。该研究首次报道裸抗原编码RNA在临床前研究中的抗肿瘤作用，提示裸RNA可以直接作为一种药物应用。

前文提到Castle等[29]发现了小鼠黑色素瘤SLP疫苗在小鼠的黑色素瘤预防与治疗上都有明显的效果。为了避免SLP结构对机体免疫系统产生影响，该团队利用编码新抗原表位的体外转录信使RNA (In vitro transcribed messenger RNA,IVT mRNA)疫苗接种荷瘤小鼠，发现编码单表位的小鼠黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌IVT mRNA疫苗也可引起小鼠以CD4+T细胞为主的免疫反应，并可抑制小鼠肿瘤生长，延长小鼠生存[48]。该团队还提出了突变组RNA免疫治疗工程(Mutanome engineered RNA immunotherapy,MERIT)的概念，综合运用二代测序、计算机免疫学以及基因组合成技术进行免疫治疗。他们将10个编码小鼠结肠癌新抗原表位的RNA整合到2个RNA疫苗上，每个RNA疫苗编码5个抗原表位，同时包含了MHCⅠ与MHCⅡ表位。结果显示，多表位RNA疫苗有明显的抗肿瘤作用，激活T细胞释放IFN-γ的能力不亚于单表位RNA，同时也显著改变了肿瘤的微环境[48]。一项基于多表位mRNA疫苗的临床研究也在进行中(NCT 02035956)。

随后Sahin等[19]提出了个体化突变组疫苗的概念，包括对单个体突变的综合鉴定、新表位的计算预测以及为每个病人设计和制造一种独特的疫苗。该团队开展了黑色素瘤新抗原个体化RNA疫苗的临床研究。该研究入组了13例Ⅲ-Ⅳ期黑色素瘤患者，在淋巴结内接种多表位新抗原RNA疫苗后，肿瘤转移性事件发生率显著降低。新抗原RNA疫苗的临床研究再次表明个体突变可以被利用，可为癌症患者提供更多治疗策略的选择。

3.3DC疫苗 DC细胞是一种重要的抗原提呈细胞，通过其表面——MHC呈递抗原：MHCⅠ类分子与CD8+T细胞相互作用，而MHCⅡ类分子与CD4+T细胞相互作用。其最大的特点是能够显著刺激初始T细胞活化，是机体T细胞免疫应答的使动者，在T细胞免疫应答的诱导中具有重要作用。DC疫苗的目标是利用激活的DC诱导Th1细胞免疫反应，并激活CTL，以消除肿瘤。FDA批准的肿瘤相关抗原疫苗Provenge是由自体PBMCs制备的，其中包括由特定前列腺癌抗原激活的DCs，DC疫苗的安全性和有效性已得到临床研究验证。肿瘤DC疫苗主要包括抗原多肽诱导和抗原RNA转导DC两种形式。

Carreno等[49]首次报道了新抗原多肽刺激DC能够诱导黑色素瘤患者产生新抗原特异性T细胞反应(NCT00683670)。该项Ⅰ期临床研究入组了3名Ⅲ期黑色素瘤患者，为每名患者选取了7个与HLA-A*02∶01结合分数高的新抗原，刺激DC细胞制备DC疫苗。结果显示接种DC疫苗可以增强对新抗原的原有免疫反应，也可以诱导新抗原特异性T细胞反应，并促进了T细胞的多样性。此外，该项研究还发现，与HLA亲和力强的新抗原并不一定是高表达或高突变的新抗原。然而，该项研究并未评价DC疫苗对3名患者治疗的临床疗效。

Forghanifard等[50]通过体外转录技术得到嵌合肿瘤相关抗原RNA，并将其电穿孔导入DC细胞，发现DC细胞可表达嵌合RNA，并诱导健康人和食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者CTL细胞的分化，在体外发挥细胞毒作用。电转肿瘤相关抗原RNA入DC能够有效地启动CTL并诱导肿瘤细胞毒性，并且嵌合RNA的成功表达提示可将新抗原与共刺激因子嵌合导入DC从而增强疗效。因此，将具有高免疫原性的新抗原的嵌合体载于DC细胞是一种潜在的有效的免疫治疗方式。

4 总结与展望

肿瘤新抗原疫苗可有效诱导新抗原特异性T细胞反应。肿瘤新抗原的广泛存在，二代测序技术和生物信息学的发展也为新抗原的发现和疫苗开发提供了支撑。但肿瘤新抗原疫苗的开发仍面临许多挑战。第一，需要降低新抗原疫苗的生产成本，缩短疫苗生产周期。目前，从组织采集到疫苗接种所需的时间从2个月到5个月不等[19，31]。对于癌细胞已经发生转移或肿瘤晚期患者，需要在较短时间完成肿瘤新抗原的鉴定和疫苗的制备。第二，新抗原预测算法需要进一步优化，包括更好地预测MHC-Ⅰ和Ⅱ类新抗原。此外，需要纳入除基因突变以外的基因变异，例如基因融合、插入和缺失。目前新抗原筛选技术基于核酸水平(全外显子组或RNA)测序，在转录后修饰和蛋白水平上尚无高通量检测方法，这限制了新抗原筛选的范围和有效性，蛋白修饰组技术的发展将为肿瘤新抗原的鉴定和新疫苗的开发提供更多的可能性。在预测肿瘤新抗原过程中，各项指标也尚无明确规范，需要在后期临床试验过程中逐渐规范，形成相关操作指南。在新抗原数量的选择上，需要进一步研究和评价单表位疫苗与多表位疫苗之间的疗效与毒性差异。第三，肿瘤新抗原疫苗仍然缺乏公认的生物标志物来预测抗肿瘤的免疫和获益情况。Martin等[46]从小鼠卵巢癌中初步发现，低突变频率可能与新抗原药疫苗疗效差有关。Sahin等[19]在临床研究中发现β2微球蛋白的表达丰度可成为预测疫苗疗效的一项潜在生物标志物。但这些生物标志物需要更多的临床证据加以证实。

随着肿瘤细胞被免疫细胞杀灭，肿瘤微环境中释放出更多的肿瘤抗原，从而引发更广泛的免疫反应，并促进免疫系统进化到针对不同抗原的多个克隆群体表达，这种现象被称为“抗原播散”[51-54]。Bollard等[54]发现抗原播散可以促进MAGE疫苗对黑色素瘤转移瘤的抑制作用，提示抗原播散对新抗原疫苗的抗肿瘤作用也会有促进作用。IFN-γ可以促进CTL对肿瘤细胞的裂解，放疗对肿瘤细胞的杀伤也可导致抗原的释放，肿瘤新抗原疫苗或许可以通过联合这些治疗手段增加疗效。此外，结合免疫检查点抑制剂，如CTLA-4单抗、PD-1单抗和PD-L1单抗，也是一种增强肿瘤新抗原疫苗疗效的有效策略。前期临床研究显示，新抗原疫苗治疗后复发的患者接受免疫检查点抑制剂后仍可获得完全缓解[31]，且二者联合治疗也表现出显著的抗肿瘤效果[19，39]。一方面，检查点抑制剂有助于恢复T细胞功能，解除肿瘤微环境中的免疫抑制状态。另一方面，肿瘤新抗原负荷与免疫检查点抑制剂的临床效果之间的相关分析表明，免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用至少部分归因于新抗原特异性T细胞[16,55-57]。二者结合不仅可以促进对疫苗相关的主要新抗原的反应，还可以增强免疫系统对次要新抗原的反应。

目前报道的肿瘤新抗原疫苗主要包括SLP、RNA和DC疫苗，DNA疫苗尚未有临床研究报道，但是有研究报道构建表达新抗原的噬菌体，可诱导B淋巴细胞的免疫反应[58]，这也成为除电穿孔技术外DNA新抗原疫苗的另一有前景的方法。肿瘤免疫治疗的DNA疫苗主要用于提供一种或几种编码肿瘤抗原的基因，从而引起或增加抗原特异性免疫反应。DNA疫苗拥有易于构建和储存、稳定、价格低廉等优势，同样具有研究和应用价值。

大部分新抗原及相关疫苗还处在研究和临床前实验阶段，还有许多问题需要解决、优化和完善。例如，在慢性感染期间，疫苗通常无法引起T细胞的扩增[59]，针对乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)核心蛋白的多肽疫苗能够使未感染HBV患者的HBV特异性反应增加30倍以上,但只能诱导HBV感染患者的HBV特异性反应增加3倍[60]。肿瘤发生时，机体已经存在了对新抗原的慢性接触，疫苗可能很难引起强烈的抗原特异性反应。但是目前多项研究已显示新抗原疫苗可引起免疫系统强烈的特异性反应，起到抗肿瘤作用，其与慢性感染具体机制的差异尚待进一步研究[19，31，49]。

总之，肿瘤新抗原的鉴定和新抗原疫苗的开发可为临床免疫治疗提供更多的选择。新抗原疫苗与其他免疫治疗(如CAR-T或PD-1单抗)、化疗或放疗联合治疗可能成为今后治疗恶性肿瘤的有效方式之一。但这个领域常处于研究阶段，还有许多基础理论和应用瓶颈需要解决。