miR-199-3p介导mTOR对骨肉瘤细胞自噬的影响

邢晓伟 郭 祥 涂源源

(海口市人民医院，海口570208)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)好发于间叶组织，其发病率占全人类恶性肿瘤中的0.2%,多发于10～20岁之间的青少年阶段[1]，研究表明青少年OS发病占OS发病患者中的70%[2]。OS的发病特点主要是发生在干骺端，因其生长极为迅速，在疾病的早期非常容易发生肺转移[3]。因此研究OS的发病机制，对深入了解疾病的发生发展以及靶向治疗有着重要意义。

自噬是由细胞内降解系统将受损细胞与被破坏蛋白与溶酶体共同融合降解的过程，对细胞正常功能及其内稳态起到维持作用[4]。目前有研究显示自噬对OS的发生、发展以及治疗具有重要的调节作用[5]。而另有研究表明通过调整microRNA(miR)可激活或抑制自噬[6]。miR作为一类长度约为22 nt的非编码短链RNA，其主要作用是通过对其下游靶基因mRNA 3′端非翻译区(Untranslated regions，UTR)进行结合，对靶基因翻译与转录过程进行抑制，从而起到改变靶基因表达的效果[7,8]。miR-199a-3p作为miR家族中的一员，此前有研究表明miR-199a-3p在OS中存在低表达[9]，可能作为OS的潜在诊断标志物，但是关于miR-199a-3p在OS中与自噬之间的关系并无相关研究。雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)作为一种蛋白激酶，具有重要的信号传导作用，参与机体生理与病理过程[10]，研究证明通过抑制mTOR可激活自噬与自噬体的形成[11]。并且本次研究通过miR靶基因预测软件预测发现miR-199-3p与mTOR之间存在靶向结合位点，通过探究miR-199a-3p与mTOR在OS中的关系，进一步探寻新的潜在治疗方案，为临床医生治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料 收集在本院进行治疗的OS患者15例，其中男9例，女6例，平均年龄(21.4±7.2)岁，手术收集患者OS组织与对应癌旁组织，切除后使用液氮保存进行后续实验，本次研究通过本院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情并签署知情同意书。纳入标准：患者通过影像学、组织活检确诊为OS患者，患者组织收集前并未进行过放化疗。排除标准：患者合并其他肿瘤，患者存在先天性免疫缺陷，患者存在其他骨关节疾病。

1.1.2细胞与试剂来源 人OS细胞U-2 OS、人成骨细胞hFOB、人胚肾细胞293t(美国ATCC细胞库，HTB-96，CRL-11372，ACS-4500)；psiCHECK-2-2质粒(中国)；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，40302ES20)；RPMI1640培养基、FBS(牛胎血清)、胰蛋白酶、青霉素链霉素双抗、TRIzol提取试剂、ECL发光化学检测试剂盒、LipofectAMINE 2000试剂盒、RIPA、BCA蛋白试剂盒(中国上海Thermo Fisher Scientific，61870044，10437028，90058，15140163，12183555，35050，11668019，23225、15224041)；PCR试剂盒TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，TransScript Ⅱ Green Two-Step qRT-PCR SuperMix(中国北京全式金生物有限公司，AT351-01，AQ301-01)；Anti-mTOR antibody、Anti-Bax antibody、Anti-Bcl-2 antibody、Anti-LC3A/B antibody、β-Actin、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(美国Abcam公司，ab2732，ab32503，ab185002，ab128025，ab124964，ab6721)；双荧光酶素检测试剂盒(美国Promega，E1910)CCK-8细胞增殖检测试剂盒(中国上海Beyotime Biotechnology，C0037)；miR-199a-3p模拟物序列、无关序列、miR-199a-3p、mTOR引物序列由上海吉玛公司设计合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染与分组 U-2 OS细胞与hFOB细胞分别置于RPMI1640培养基(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素双抗，10%FBS)中,在37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。当U-2 OS细胞生长至对数生长期时，取细胞将其密度调整至5×105个/孔，分别接种至6孔板中，观察细胞融合情况，当细胞融合至70%～80%对细胞进行转染，使用LipofectamineTM2000转染试剂盒，按照试剂盒说明书对U-2 OS细胞进行转染，细胞共分为空白组、无关序列组(NC组)、过表达组(miR-199-3p-mimic组)，转染浓度为20 nmol/L，共转染48 h。

1.2.2CCK-8细胞增殖检测 取对数生长期U-2 OS细胞0.25%胰蛋白酶进行消化计数，使用PBS洗涤，进行重悬将密度调至1×105个/ml，分别接种于96孔板中，每孔加入100 μl细胞，细胞贴壁后转染对应序列，温育48 h，随后每孔加入10 μl CCK-8试剂，37℃条件下孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长进行吸光度检测，每组设3个重复孔，实验共重复3次，实验结果取平均值。

1.2.3细胞与组织中miR-199a-3p与mTOR相对表达检测 收集转染与未转染U-2 OS、hFOB细胞、患者组织，采用TRIzol提取试剂进行总RNA的提取，将提取后的总RNA使用紫外分光光度仪与琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度、浓度与完整性。miR-199a-3p检测方法如下：使用PCR试剂盒中自带的逆转录试剂盒对与总RNA进行反转录，操作步骤严格按照试剂盒说明进行操作。随后进行PCR扩增实验，PCR反应体系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransTaq®Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(×50)0.4 μl，最后加入ddH2O补全至20 μl。PCR反应条件：94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共进行40循环。每个样品设3个重复孔，实验共进行3次。本次研究使用U6作为内参，使用2-ΔΔCt对本次数据进行分析。mTOR检测方案如下，使用PCR试剂盒中自带的逆转录试剂盒进行反转录操作，步骤严格按照试剂盒说明进行操作。随后进行PCR扩增实验，PCR反应体系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransScript®Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(50×)0.4 μl，最后加入Nuclease-free Water补全至20 μl，PCR反应条件：94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共进行40循环。每个样品设3个重复孔，实验共进行3次。本次研究使用GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCt对本次数据进行分析。使用美国ABI公司 7500PCR仪进行检测。引物序列见表1。

1.2.4Western blot(WB)检测 收集转染后的各组细胞使用RIPA裂解法提取总蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度，将蛋白浓度调整至4 μg/μl，12%SDS-PAGE电泳分离,电离后转膜至PVDF膜上，使用丽春红工作液中染色，PBST浸泡5 min洗涤，使用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ一抗(1∶1 000)4℃封闭过夜。洗膜除去一抗，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min。暗室中显影，用滤纸吸干膜上多余液体，ECL发光，显影。扫描蛋白条带，于Quantity One软件中分析灰度值，其中蛋白的相对表达水平=目的蛋白质条带灰度值/β-Actin蛋白质条带灰度值。

1.2.5细胞凋亡情况检测 转染后的细胞使用0.25%胰蛋白酶进行消化，消化后使用PBS洗涤2遍，加入100 μl的结合缓冲液，将其配制成1×106个/ml悬液，依次加入Annexin V-FITC与PI，室温避光孵育5 min，使用FC500MCL流式细胞仪系统进行检测，实验重复3次取平均值。

1.2.6靶基因预测与双荧光酶素报告 采用Targetscan7.2与miRwalk预测miR-199a-3p下游靶基因，分别将含有野生型与突变型mTOR 3′UTR的报告基因质粒、psiCHECK-2质粒(美国Promega公司，C8021)、miR-199a-3p-mimic及其对照转染至293T细胞中转染48 h后采用，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行操作，最后收集细胞采用化学发光酶标仪进行检测。每组实验设计3个重复，每次实验重复3次。

2 结果

2.1OS患者组织与细胞中miR-199a-3p、mTOR相对表达情况 RT-qPCR检测患者癌组织与癌旁组织中miR-199-3p、mTOR相对表达，结果显示患者癌组织中miR-199a-3p表达明显低于癌旁组织，而癌组织中mTOR表达明显高于癌组织吗，差异具有统计学意义(P<0.05)，U-2 OS细胞中miR-199a-3p表达明显低于hFOB细胞，而U-2 OS细胞中mTOR表达明显高于hFOB细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2U-2 OS细胞转染后miR-199a-3p与mTOR相对表达情况 RT-qPCR检测转染后U-2 OS细胞中miR-199a-3p表达，结果显示miR-199a-3p-mimic组细胞中miR-199a-3p表达情况明显高于NC组与空白组(F=36.631，P<0.001)，NC组与空白组比miR-199a-3p表达无差异，而检测mTOR相对表达结果显示miR-199a-3p-mimic组细胞中mTOR表达情况明显低于NC组与空白组(F=17.901，P=0.030)，NC组与空白组比miR-199a-3p表达无差异，见图2。

2.3细胞增殖情况 RT-qPCR检测转染后U-2 OS细胞48 h相对增殖情况， 发现miR-199a-3p-mimic组细胞增殖情况明显受到抑制低于NC组与空白组(F=11.944，P=0.008)，NC组与空白组比相对增殖情况不存在差异，见图3。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstream primerDownstream primermiR-199a-3p5′-GCCACAGTAGTCTGCACAT-3′5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′mTOR5′-AGGCCTTGGTGAGAGCTGTA-3′5′-GGCACACATTTGAAGAAGCA-3′U65′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′GAPDH5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′

2.4细胞凋亡情况 流式细胞仪检测转染后细胞凋亡情况，结果显示空白组(16.77±1.84)与NC组(3.25±0.75)细胞凋亡情况明显要低于miR-199a-3p-mimic组(3.38±0.84)(F=116.783，P<0.001)，而空白组与NC组细胞凋亡情况不存差异，见图4。

2.5转染后细胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表达情况 WB检测转染后3组细胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ蛋白表达，结果显示miR-199a-3p-mimic组细胞中Bax、LC3-Ⅱ蛋白与LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显高于NC组与空白组差异具有统计学意义(P<0.05)，而mTOR、Bcl-2、LC3-Ⅰ 蛋白表达明显低于NC组与空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，NC组与空白组mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ 及LC3- Ⅱ/Ⅰ 比值无明显差异(P>0.05)，见图5。

图1 细胞与组织中miR-199a-3p 与mTOR 相对表达情况Fig.1 Relative expression of miR-199a-3p and mTOR in cells and tissuesNote: A.Relative expression of miR-199a-3p in tissues；B.The relative expression of mTOR in tissues；C.Relative expression of microRNA-199a-3p in cells；D.Relative expression of mTOR in cells.*.P<0.05，***.P<0.001.

图2 细胞转染后miR-199a-3p相对表达Fig.2 Expression of miR-199a-3p after cell transfectionNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

2.6miR-199a-3p与mTOR靶点预测与双荧光酶素报告 通过Targetscan7.2与miRwalk在线软件预测发现miR-199a-3p与mTOR之间存在靶向结合位点，因此我们通过双荧光酶素报告进行了验证。psiCHECK-2-2-mTOR-WT组中miR-199a-3p-mimic荧光素酶活性明显低于无关序列组(P<0.05)，而psiCHECK-2-2-mTOR-MUT组中miR-199a-3p-mimic与无关序列组荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)，见图6。

图3 48 h 细胞相对增殖情况Fig.3 Relative proliferation of cells at 48 hNote: **.P<0.01.

图4 流式细胞计数Fig.4 Flow cytometryNote: A.Apoptosis in miR-199a-3p-mimic group;B.Apoptosis in NC group;C.Apoptosis in blank group.

图5 mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表达情况Fig.5 Expression of mTOR,Bax,Bcl-2,LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ proteins

图6 双荧光酶素报告Fig.6 Double fluorescent enzyme reportNote: *.P<0.05.

3 讨论

OS是一种常见于青少年的原发恶性肿瘤，并且多发于长骨干骺端，研究表明OS每年发病率为3/100万，并且女性患者发病率略高于男性[12，13]。目前临床上常通过术前辅助化疗，手术切除以及术后辅助化疗的方案来改善患者病情[14]。随着医疗水平的不断提升OS患者的预后与生存率得到了显著改善，但是其5年生存率还是不超过70%[15]。是否能进一步提升患者生存率，是临床医生与科研人员亟待解决的难题之一。

miRNA是近年来的研究热点，在多种细胞的发展过程中起着关键作用，与细胞的分化、形态及肿瘤的发生关系密切[16]。miR-199a-3p作为一种高度保守的miRNA，可调节多种细胞的生长，Wang等[17]研究发现miR-199a-3p可通过抑制视网膜母细胞瘤1诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的凋亡。Li等[18]研究显示miR-199a-3p通过下调SerpinE2参与糖尿病神经病变的发病机制与进展，Qu等[19]研究表明miR-199a-3p通过靶向Smad1抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭。上述研究显示miR-199a-3p参与多种疾病的发生、发展，可作为多种肿瘤或疾病的潜在治疗靶点。但是在OS中是否具有同样的作用，研究较少。因此本文研究miR-199a-3p在OS中的作用及其相关机制。

本次研究我们首先检测了OS患者癌组织与癌旁组织中miR-199a-3p的表达，发现患者癌组织中miR-199a-3p表达明显降低，Duan等[20]研究通过芯片筛查发现miR-199a-3p在癌组织中的表达同样低于癌旁组织，这与我们的研究结果相似，并且我们还通过检测U-2 OS细胞与hFOB中miR-199a-3p的表达进一步验证，其表达与患者组织中的表达相似，验证了其正确性。但是关于miR-199a-3p在OS中的相关机制尚不清楚，我们进一步将其过表达转染至U-2 OS细胞中，通过观察细胞增殖与凋亡情况，发现miR-199a-3p-mimic组中细胞凋亡情况明显增加，而细胞增殖情况明显受到抑制，并且通过检测miR-199a-3p-mimic组中凋亡蛋白的表达发现Bax蛋白表达明显上升，而Bcl-2表达明显降低，这提示我们通过过表达miR-199a-3p可有效抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡。然而关于是通过何种方式来抑制细胞增殖和促进凋亡尚不清楚。自噬是一种细胞通过自我吞噬的代谢途径，其通过降解与回收细胞内受损的细胞器，来维持细胞的稳态[21]。研究表明自噬不仅可维持细胞内稳态还参与了多种病理过程[22]。mTOR作为细胞增长、增殖、分化等重要生物学功能的调控因子，具有重要的生物调节作用，不仅如此其还可对自噬过程中自噬体形成起到抑制作用[23]。研究显示通过抑制mTOR的表达而激活自噬的发生[24]。我们通过miRNA靶基因在线预测工具筛查发现mTOR与miR-199a-3p之间存在靶向结合点位，通过双荧光酶素报告证实了两者之间存在靶向结合关系。为此我们推测miR-199a-3p能通过抑制mTOR的表达从而激活自噬的发生。因此我们对细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值表达进行了检测。LC3-Ⅱ/Ⅰ比值作为自噬的标志物，其表达的高低可直接反映自噬情况[24]。我们通过检测miR-199a-3p-mimic组中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的表达，发现miR-199a-3p-mimic组中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值表达明显上升，而在Wang等[25]人的研究中显示通过黄芩素上调了DDIT4的表达，从而有效抑制mTOR的表达，激活了自噬的发生，而我们的研究正是通过调节mTOR上游靶基因来改变mTOR的表达引起自噬，这提示miR-199a-3p可能是治疗OS新的潜在治疗靶点。

本次研究初步证明了过表达miR-199a-3p抑制mTOR的表达从而引起自噬，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。但是我们本次研究还是存在一定的局限性，首先我们并没有建立miR-199a-3p抑制组，通过抑制miR-199a-3p的表达对OS细胞存在什么样的影响尚不清楚，其次我们仅检测了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值并未对其他自噬形成标志物进行检测，最后我们在miR-199a-3p靶基因预测时发现DDIT4与miR-199a-3p同样存在结合位点，miR-199a-3p是否可通过调节DDIT4的表达间接调控mTOR尚不清楚。因此我们希望在今后的研究中增加我们的实验内容，进一步探究miR-199a-3p与DDIT4之间的关系来补充我们的实验结果。

综上所述，过表达miR-199a-3p可抑制mTOR的表达引起细胞自噬,从而促进细胞凋亡降低细胞增殖。