西瓜液泡糖转运蛋白是西瓜含糖量QTL区间的主效基因

任毅 郭绍贵 张洁 何洪巨 孙宏贺 田守蔚 宫国义 张海英 许勇

目的与意义： 西瓜（Citrullus lanatus）果实中的可溶性糖积累是西瓜长期驯化过程中主要品质性状之一。目前，关于西瓜中糖转运蛋白是如何调节果实中各种糖积累的这一机制尚不清楚，特别是像西瓜这种储存高浓度蔗糖的作物。笔者旨在缩小已报道的糖含量QTL的区间，以及构建超高密度SNP遗传图谱来确定QBRX2-1 QTL的决定基因，并阐明西瓜驯化过程中糖分积累的分子机制。

材料与方法：对高糖西瓜栽培品种‘97103（Citrullus lanatus var. lanatus）和低糖西瓜野生品种‘PI296341-FR（C. lanatus var. citroides）杂交后产生的96株系RIL群体进行了重测序，并构建超高密度SNP连锁图谱精细定位含糖量QTL。结合不同的生化和遗传方法，验证结果并得出结论。

结果与分析： 连续3年鉴定96株系RIL群体的Brix（可溶性固形物），Fru（果糖），Glc（葡萄糖）和Suc（蔗糖）含量并做了表型分析。试验结果显示，除Suc外，其他几种糖含量性状的遗传力（h2）相对较高（>85%）。含糖量QTL精细定位结果证明，Cla000264为QBRX2-1糖含量QTL的决定基因，Cla000264与拟南芥液泡膜单糖转运蛋白基因AtTST2具有约78%的氨基酸一致性和88%的序列相似性。因此，将这种西瓜基因命名为C. lanatus tonoplast sugar transporter 2（ClTST2）。

在西瓜基因组数据库中确定了3个ClTST直系同源物，比较高糖栽培品种‘97103和低糖野生品种‘PI296341-FR的不同组织中ClTSTs的表达，证实ClTST2 mRNA转录水平与Suc积累正相关。相反，ClTST1和ClTST3在西瓜果实糖积累期间表达较低。对96株系RIL群体成熟果实和核心种质中进行了qRT-PCR，证实了ClTST2转录与西瓜果肉中糖含量呈正相关。ClTST2 过表达转基因株系中果肉糖含量明显增加，表明较高的ClTST2表达水平是增加西瓜果肉糖积累所必需的。

将高糖栽培品种97103-ClTST2序列与黄色荧光蛋白（YFP）基因融合并转化西瓜果实原生质体，证实西瓜糖转运蛋白ClTST2的液泡膜定位。将97103-ClTST2与GFP基因融合，并在人胚肾细胞293T（HEK293T）细胞中瞬时过表达融合基因，在HEK293T细胞的质膜中观察到融合蛋白的绿色荧光，发现了 HEK293T细胞中ClTST2的细胞膜定位。通过膜片钳技术在HEK293T表达栽培种‘97103 ClTST2基因，通过电流变化验证了ClTST2的转运功能。当把50 mmol·L-1 Suc置于HEK293T细胞膜的外部时，携带ClTST2的细胞相对于负对照电流的响应，将50 mmol·L-1 Fru和Glc置于HEK293T细胞膜的外部时表现出相同的结果，而在不存在ClTST2的情况下，HEK293T细胞未显示出明显的电信号。为了证实这一结果，在非洲爪蟾的卵母细胞中进行了放射性标记的糖外排试验。试验中，瞬时过表达非洲爪蟾卵母细胞中的ClTST2-GFP，再次确认ClTST2的质膜定位，把被[14C]标记的糖注射到非洲爪蟾卵母细胞中，[14C]标记的糖随着时间变化而外排，ClTST2蛋白在pH 6.5下表现出对Suc、Fru和Glc的转运活性。

杂交高糖栽培品种‘97103和低糖的‘G35 RIL产生的西瓜近等基因系（NILs），它与栽培种‘97103具有很高的遗传同一性和表型相似性。BC2的亲本F1植物（97103×G35）回交‘97103，BC2F1自花授粉产生BC2F2群体，此举可以分析ClTST2等位基因變异对同一西瓜果实类型中果实糖积累的影响。通过qRT-PCR分析亲本和后代的成熟果实的可溶性固形物含量和ClTST2 mRNA转录水平，结果表明ClTST2表达与西瓜果肉中糖积累呈正相关。同样在栽培草莓（F. ×ananassa）中瞬时表达该基因，从而间接验证了在西瓜RIL群体中ClTST2在西瓜中的糖转运活性，所以，较高的糖浓度可加速西瓜果实向成熟过渡。

目前还没有任何报告关于植物中特定转录因子对TST基因的调节。为了在功能上确定主要的表达调节区域，将ClTST2启动子区域5端的不同长度的DNA片段与荧光素酶（LUC）基因融合，并在草莓果实和烟草叶中瞬时表达，调节ClTST2表达的DNA序列元件可能位于-1 000和-1 500 bp之间。结果表明，在高糖西瓜中A/C颠换SNP（-1 368）改变了W box3，其可以作为WRKY转录因子的结合位点，其调节ClTST2表达并且在糖积累中起关键作用。

ClTST2位于QTL区间的40 kb驯化区域，ClTST2启动子区域的W box3中的-1 368个SNP（A/C）解释了124个种质中的大部分糖含量变化。结果表明，西瓜中果实糖积累需要ClTST2活性。此外，该结果揭示了在西瓜驯化过程中更高的ClTST2表达被选择出来，导致西瓜中糖的积累增加。分析表明，果实发育相关的细胞代谢基因、囊泡介导和细胞内转运蛋白在选择过程中表现出富集状态。该结果表明，在驯化期间ClTST2被选择，促进西瓜果实中的糖积累。

结    论：研究结果表明，ClTST2是一种定位于西瓜糖含量QTL区域的糖转运蛋白基因，它编码一个液泡定位的Suc、Fru和Glc转运蛋白。与对照相比，ClTST2的过表达导致糖含量显著增加。由SUSIWM1上调的ClTST2 mRNA转录水平与果实成熟期间的糖积累显著正相关。由此得出结论，ClTST2是调控西瓜果实细胞液泡中Suc、Fru和Glc积累的关键转运蛋白。