一个新的磷转运蛋白ClPHT4;2的高表达是 西瓜瓤色发育的必要条件

张洁 郭绍贵 任毅 张海英 宫国义 周明 王贵章 宗梅 何洪巨 刘凡 许勇

目的与意义：果实瓤色变化是西瓜果实成熟的重要标志。西瓜果肉细胞中的有色体不断发育并积累各种类胡萝卜素物质导致了西瓜果实瓤色的出现。前人的研究着重于分析在类胡萝卜素合成途径中各种重要酶类的变化对瓤色的影响，而对于作为类胡萝卜素代谢途径载体的有色体的发育过程的解析不足。我们着重分析了不同瓤色西瓜中有色体的发育过程的异同，并发现了保障其正常运转的重要转运蛋白。其中一类磷转运蛋白（PHT）在模式作物拟南芥的研究中表明，其对维持叶绿体、淀粉体等质体的代谢反应起到举足轻重的作用，但PHT在有色体中的作用与功能尚无报道。基于西瓜不同发育时期转录组测序数据，我们在西瓜中首次发现一个在果实中特异表达的基因PHT类基因，该基因在红瓤和白瓤西瓜中的表达量和转录调控区序列存在显著差异，因此，我们极为关注该基因的功能及其蛋白表达及转录调控是否最终影响有色体的发育，从而影响西瓜瓤色形成。

材料与方法：选取西瓜試验材料为东亚类型的红瓤栽培品种‘97103（Citrullus lanatus subsp. vulgaris East-Asia Ecotype）和近缘白瓤野生种‘PI296341-FR（Citrullus lanatus subsp. lanatus）。通过透射电镜观察西瓜果肉细胞的亚细胞结构中有色体的发育及成熟过程。通过密度梯度离心法提取西瓜果实完整有色体。提取不同果实不同发育阶段的RNA，进行果实转录组测序（美国康奈尔大学费章军教授合作完成）。通过互补酵母磷转运缺陷株验证其磷转运蛋白的功能。制作了该蛋白的特异抗体，通过免疫胶体金亚细胞定位结合果肉细胞原生质体转化等方法确定候选蛋白的表达部位。通过对该基因序列及表达水平的差异分析，发现特异的顺式调控元件，利用酵母单杂交体系进行候选转录因子的筛库试验。结合EMSA试验及烟草叶片瞬时转化试验，检测候选转录因子与启动子的结合能力。同时还试验了糖分、ABA、乙烯及其抑制剂处理对西瓜瓤色发育的影响。

结果与分析：首先分析了红瓤材料‘97103与白瓤材料‘PI296341-FR在果瓤细胞发育中的差异。通过透射电镜观察发现，在红瓤材料中细胞中有更多的前质体发育为有色体，且在有色体中大量积累了类胡萝卜素类物质。而白瓤果实中的有色体发育少，且其中只积累了为数不多的类胡萝卜素色球。此外研究还发现，红瓤西瓜果瓤细胞中的有色体质膜在有色体发育过程中变化明显。在深入了解西瓜有色体发育的基础上，通过反向遗传学分析发现了一个在果实中特异表达的磷转运蛋白基因ClPHT4;2（基因编号：Cla017962），其表达情况与红瓤西瓜有色体发育过程一致，且通过酵母磷转运缺陷株验证了其磷转运蛋白的功能。进一步通过免疫胶体金及荧光共定位分析发现，ClPHT4;2蛋白确实定位在有色体质膜上。这些结果揭示了该蛋白在有色体发育中具有重要功能。通过果实转录组测序的结果及荧光定量PCR试验证实ClPHT4;2基因是果实特异表达的转运蛋白基因，且该转运蛋白的转录水平在2个品种的果瓤变化上差异显著。随着‘97103果实的发育，该基因表达水平显著提高，与授粉后10 d的果实相比，授粉后26 d果实中基因表达量提高了近250倍。而在‘PI296341-FR的果实发育中该基因一直维持在较低的表达水平。基因表达水平依赖于基因启动子上游调控区的序列特征，比较2个品种该基因5上游1 500 bp调控区的碱基序列可以发现有20处单碱基变化。进一步研究发现，该基因启动子区的顺式调控元件在2个品种间存在显著不同，由于SNP的变化使得‘97103基因启动子序列中多出了2个ABRE及一个ERE结构域。这2种调控元件的产生意味着在‘97103中该基因可能受到更多信号的调控，我们认为顺式调控元件的出现可以部分揭示‘97103品种中该基因表达水平迅速提高的原因。通过筛选控制ClPHT4;2基因在不同瓤色西瓜品种中差异转录的关键因子，得到了可以结合该ABRE结构域的2个候选bZIP类转录因子。此外还研究了糖分、ABA及乙烯途径对果实瓤色发育的调控作用。

结    论： 清晰系统地阐明了西瓜白瓤野生种进化到栽培种西瓜中有色体发育过程的异同;并且首次揭示了栽培西瓜后期大量有色体破裂形成番茄红素小囊，是西瓜比番茄中的番茄红素更容易吸收的一个重要原因;此外还发现了一个定位于有色体质膜中的磷转蛋白基因的高量表达，是栽培西瓜瓤色形成的必要条件。针对该新发现的磷转运蛋白基因的进一步研究表明，该基因可以被成熟相关因子如ABA、乙烯以及糖浓度所调控。该项研究为一步揭示激素及糖分信号调控果肉细胞有色体发育提供了重要的节点基因证据，为全面阐明果实有色体发育机制提供理论基础。