比较基因组学在甜瓜白粉病抗病基因 Pm-2F连锁标记开发中的应用

孙洪宝 许勇 张春秋

目的与意义：近年来随着保护地甜瓜生产的迅速扩大，在高温高湿的环境下，甜瓜白粉病的发生变得越来越严重，白粉病已经成为甜瓜绿色无公害生产的主要障碍，危害日益严重。研究发现，中国大部分地区的甜瓜白粉病菌由Podosphaera xanthii （P. xanthii）引起，其中小种2 France是主要的优势生理小种。采用BSA法，开发与甜瓜白粉病P. xanthii 2F生理小种的抗性基因连锁的系列分子标记，并实现精确定位。研究结果将为分子标记辅助甜瓜抗白粉病育种和甜瓜白粉病抗性基因克隆奠定基础。

材料与方法：利用日本类型抗白粉病的甜瓜自交系‘K7-1为父本，新疆典型的哈密瓜感白粉病品种‘K7-2为母本，杂交获得F1代，并建立了F2分离群体。从F2材料中随机抽样自交，通过单粒传获得重组自交系构成 RIL群体，共 106 个单系。采用孢子悬浮喷雾法进行抗白粉病苗期接种鉴定，在甜瓜基因组未知的情况下，利用黄瓜—甜瓜比较基因组结合BSA法将黄瓜对应区域的标记在甜瓜分离群体的抗感亲本和抗感池进行多态性分析;并将筛选到的与甜瓜基因Pm-2F连锁标记比较定位至黄瓜染色体，并利用黄瓜同源区域的分子标记和基因组序列信息，进一步开发与Pm-2F基因紧密连锁的分子标记，通过多态性连锁标记分析106个株系的RILs群体对Pm-2F基因进行定位;利用开发的紧密连锁标记对甜瓜165份种质资源和13份鉴别寄主材料进行标记分析验证标记的有效性。

结果与分析：通过对RIL分离群体的遗传分析明确了‘K7-1对白粉病菌生理小种P. xanthii 2F的抗性由显性单基因控制。利用甜瓜连锁群的660对分子标记在抗感亲本和抗感池中进行多态性筛选得到与抗性基因连锁的多态性标记1对，分别是CMBR120和CMBR8，2个标记与目标基因的遗传距离分别是0.9、1.9 cM。利用甜瓜—黄瓜比较基因组将以上2个与抗白粉基因Pm-2F连锁标记序列与黄瓜基因组进行比对，发现该区段对应于黄瓜1号染色体上。进一步利用黄瓜1号染色体上已发表的136对SSR分子标记在抗感亲本中进行多态性筛选，发现在抗感亲本间有28对引物存在多态性，而这28对在抗感亲本间具有多态性的分子标记中，仅有SSR02733、SSR027334和CS27在抗感池间具有多态性。在106个株系的RILs群体中验证引物CS27、SSR02733、SSR02734、CMBR8、CMBR120的多态性。利用软件JoinMap4.0繪制遗传连锁图，将基因Pm-2F初步定位在LGⅡ上2.4 cM之间，两侧 翼标记为CMBR8和SSR02734（SSR02733）与Pm-2F的连锁距离分别为0.5 cM和1.9 cM。

为进一步缩小Pm-2F基因目标区段的范围，将上述具有多态性的标记序列比对到黄瓜基因组，发现所有标记序列在黄瓜1号染色体上均能找到同源区段，CMBR120、SSR02733、SSR02734和CMBR8标记在黄瓜染色体上的排列顺序与甜瓜连锁图中的一致，而CS27标记在甜瓜连锁图上发生了重排。标记所定位目标区域覆盖黄瓜基因组总长288 233 bp （Chr1 21 068 471-21 356 694）。对该区域的候选基因进行预测发现，目标区域共有49个基因，其中包括2个NBS-LRR类抗病基因（基因编号分别为Csa1M572370.1 和 Csa1M572380.1），并且这2个基因位于Pm-2F基因的2个侧翼标记CMBR8和SSR02734之间，由此推断Csa1M572370.1 和 Csa1M572380.1为Pm-2F的同源基因。

针对这上述2个抗病基因，参考黄瓜的基因序列进行设计特异引物，在甜瓜抗感亲本中扩增产物唯一且长度为466 bp。在纯合抗白粉病基因型DdeⅠ酶切后为359 bp和107 bp的条带;杂合抗白粉病不能够完全酶切，酶切后产生466 bp、359 bp、107 bp 3条带;感病基因型由于没有相应的酶切位点，因此酶切后仍为466 bp 1条带。该标记与目标基因的遗传距离为0.3 cM。利用该标记对甜瓜165份种质资源和13份鉴别寄主材料进行标记分析，发现在165份种质资源材料中标记分析基因型和表型的吻合率为97%，在13份鉴别寄主材料中仅有基因型和表型4份不吻合，其中有2份抗病材料的基因型与感病亲本条带一致，可能该材料中存在其他抗病基因。

结    论： 确定了抗性材料‘K7-1对白粉病菌生理小种P. xanthii 2F的抗性由显性单基因控制，将Pm-2F基因定位在0.8 cM的区间，两侧翼标记与目标基因的连锁距离为0.5和0.3 cM，同时研究表明，利用黄瓜基因组可以成功地用于甜瓜标记的开发，比较基因组学为利用已测序模式植物的基因组开发近缘物种的分子标记提供了新的思路与方法。