西瓜全基因组SSR位点的特征及其在比较遗传作图 和遗传多样性分析中的应用

朱华玉 宋芃垚 郭禄芹 李严曼 孙守如 杨路明

目的与意义： 随着新一代全基因组测序技术的快速发展，越来越多的物种开发了大量的覆盖全基因组的SSR标记。虽然在西瓜上也开发了一些SSR标记，并已经在连锁图谱和遗传多样性研究中得到应用，但仍存在多态性低、基因组覆盖率低等问题。本研究从西瓜全基因组水平分析了不同类型SSR序列的分布及頻率。并开发了覆盖全基因组的SSR标记，同时通过电子 PCR的方法确定了在甜瓜、黄瓜中通用的SSR分子标记，并利用这些通用SSR标记进一步明确了西瓜与黄瓜以及甜瓜3个物种之间的染色体共线性关系。本研究同时筛选了32对高多态性SSR标记对134份西瓜材料进行了遗传多样性及群体结构分析。

材料与方法： 利用西瓜全基因组序列（http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi），用MISA（Microsatellite identification tool） 软件识别SSR序列。用Primer3 （v. 1.1.4）进行SSR引物设计。将西瓜全基因组SSR标记通过perl语言编写的脚本，利用BLAST分别在黄瓜和甜瓜基因组中进行电子PCR分析。西瓜、甜瓜、黄瓜之间染色体的共线性用 Circos software v 0.55 （http：//circos.ca）分析。并利用荧光原位杂交（FISH）验证染色体之间的共线性。选取134份西瓜材料提取基因组DNA，利用西瓜SSR标记和GeneAlEx 6.5、MEGA5、STRUCTURE2.3软件进行遗传多样性和群体结构分析。

结果与分析： （1）对东亚栽培型西瓜‘97103的353.5 Mb序列分析，共得到39 523个SSR位点。所有SSR的总长度占西瓜基因组草图全长的0.28%，平均为111个/Mb 。在不同个数的核苷酸重复类型中，SSR出现的频率与核苷酸基数呈负相关。SSR出现的频率随着重复单元数量的增加而减少，与SSR重复单元的长度之间的关系尤为明显。统计了每种SSR序列的核苷酸组成，发现AT、AAT、AAAT、AAAAT、AAAAAT、AAAAAAT和AAAAAAAT是每个重复类型中最丰富的重复基序。研究了每条西瓜染色体上SSR类型的频率和分布，发现SSR位点的频率与染色体大小无关。（2）为了确定西瓜SSR标记在葫芦科不同物种间的应用，利用黄瓜和甜瓜的基因组序列作为模板，用西瓜全基因组SSR标记进行电子 PCR分析。在西瓜和黄瓜间通用的标记共891个，覆盖黄瓜基因组190.42 Mb，占黄瓜基因组全长的98.87%，平均每条黄瓜染色体上有119个标记。西瓜和甜瓜中的通用标记共969个，覆盖甜瓜基因组的310.94 Mb，占甜瓜基因组全长的98.29%，平均每条甜瓜染色体上有72个标记。在黄瓜、甜瓜、西瓜3个物种中都通用的SSR标记有448个，其在西瓜染色体上的分布见图3。对西瓜的448个SSR标记进行电子PCR分析，将其产物利用EST、unigenes和CDS数据库进行BLAST分析，其中在EST数据库中可以检测到21个SSR标记，19个SSR标记在unigene数据库中表达，其中210个位于编码区表明这些SSR标记与基因功能相关。（3）根据通用标记在黄瓜和西瓜对应的染色体上的位置，对两个物种染色体之间的共线性关系进行推断。西瓜和黄瓜之间的染色体共线性关系相对复杂，详见表3。根据通用SSR标记在两个物种基因组上的位置，可以将西瓜的染色体分为不同的区段，平均每个区段至少有3个SSR标记。在明显区分的84个区段内，有44个与黄瓜的染色体有较好的共线性，其余的40个在两者之间有倒位现象。将西瓜与甜瓜之间做了类似的比较，在925个通用的SSR标记中有850个可用于两者染色体共线性的分析。尽管西瓜和甜瓜具有相似的染色体数目，但他们染色体之间的线性关系非常复杂。为了更直观地了解葫芦科植物的染色体之间的进化关系，以西瓜染色体为背景，对黄瓜和甜瓜的染色体进行重组作图。该图很好地解析了葫芦科3个物种之间的染色体共线性关系。进一步利用原位杂交（FISH）的方法对基于SSR标记的染色体线性关系进行了验证。荧光原位杂交的结果与利用SSR标记的比较作图结果完全一致。（4）选择分布于西瓜11条染色体上的32对多态性好的SSR标记进行西瓜遗传多样性和群体结构分析。结果显示32个SSR标记在134份材料中的多态性表现良好。遗传多样性分析和群体结构分析都将134份种质分为2个类群，结果几乎完全一致。从同一大陆收集的种质并不完全聚为一类，表明西瓜已经发生了不同的程度迁移和大陆之间的相互交流。

结    论：本研究基于西瓜全基因组序列对各种SSR重复基序的频率和分布等特征进行了统计分析，并开发了覆盖西瓜全基因组的SSR标记。通过电子PCR的方法，对在西瓜、黄瓜、甜瓜3个物种间通用性SSR标记进行了筛选，这些标记为更准确地揭示三者基因组之间的共线性关系提供了充足的标记来源。此外，利用32对高多态性引物对134份材料进行聚类和群体结构分析，两种分析结果高度一致。本研究开发了大量的SSR分子标记和跨种间通用SSR标记，这些标记将会在图谱构建、基因定位、比较作图和分子标记辅助育种等研究领域得到大量应用，同时也可为葫芦科其他未完成测序物种提供重要的标记资源。