基于可视化环介导等温扩增技术 快速、灵敏检测瓜类蔓枯病菌

姚协丰 李苹芳 徐锦华 张曼 任润生 刘广 羊杏平

目的与意义： 蔓枯病（gummy stem blight，GSB）是葫芦科作物（比如哈密瓜、香瓜、黄瓜和西瓜等）的世界性病害，往往危害茎和叶，且通过温室育苗和修剪被侵染植株而交叉感染传播，也可通过种子带菌传播。在有利的环境条件下，低水平的潜在侵染苗有可能导致病害大流行。大棚内的高湿环境有利于瓜类蔓枯病发生，已成为瓜类生产中继枯萎病之后最严重的病害之一。蔓枯病菌（Didymella bryoniae）是导致葫芦科作物蔓枯病的病原，蔓枯病菌的早期诊断、灵敏、快速的检测对于限制蔓枯病在温室育苗或田间移栽的传播具有重要意义。本研究基于环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP），建立可视化、快速、灵敏的瓜类蔓枯病菌检测体系。

材料与方法： （1）对瓜类蔓枯病菌和其他对照菌株（蔓枯病菌、菜豆褐斑病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜链格孢叶斑病菌、葫芦轮枝镰孢菌、西瓜枯萎病菌0号生理小种、西瓜枯萎病菌1号西瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌2号生理小种）的菌丝真空干燥后采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）试剂盒进行DNA提取。瓜类蔓枯病原菌人工喷雾接种甜瓜植株，收集接种甜瓜叶片和对照叶片，然后通过DNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取DNA。（2）利用引物設计软件网站（PrimerExplorer V4），根据来源于RAPD（random amplified polymorphic DNA）的标记（GenBank GQ872461，GQ872462）通过软件设计LAMP特异性引物4组。设计的LAMP引物，包括一对内引物，一对外引物和后环引物。（3）LAMP反应的优化，选择不同试剂，不同浓度优化最佳浓度：设计Bst DNA聚合酶量范围 （2～8 U），dNTPs浓度范围（2～10 mmol·L-1），镁离子浓度范围（2～8 mmol·L-1），引物浓度范围（2～4 mmol·L-1），氯化锰浓度梯度（0.1～1.0 mmol·L-1），钙黄绿素浓度梯度（2～8 mmol·L-1）。选择LAMP最适反应温度及最佳反应时间优化，设计温度梯度：61 °C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C、66 °C、68 °C。设计LAMP反应时间梯度：60、45、30、15 min。LAMP反应特异性检测，以5种不同蔓枯病菌（包括RAPD Group I和II）和7种葫芦科病原菌及一种与蔓枯病菌同属的菜豆褐斑病原菌，检测LAMP引物特异性和区分度。LAMP反应灵敏度检测，设计不同浓度梯度DNA为模板：105、104、103、102、10、1、10?1 浓度的DNA（fg·μL?1） ，LAMP和常规PCR的比较。LAMP方法最低检测下限和常规PCR检测下限比较。（4）LAMP检测人工接种蔓枯病菌侵染叶片，以两种不同基因型蔓枯菌株D. bryoniae（DBJSJY2、DBZJNB7）和无菌水为对照，喷雾接种甜瓜植株。选取前3天无明显病斑叶片和对照甜瓜叶片提取DNA，用于LAMP检测侵染叶片的特异性。

结果与分析：（1）通过63 °C恒温30 min可以检测包括RG I和RG II在内的所有基因型蔓枯菌株，特异性引物涵盖蔓枯基因型广泛，结合钙黄绿素（calcein）的荧光显色指示剂作用，建立了目测可视化的蔓枯病菌快速检测体系。（2）笔者开发的LAMP检测蔓枯病菌体系，灵敏度为常规PCR反应的1 000倍，检测下限达到 0.1 fg·μL?1，与之前报道的LAMP方法检测菌核病菌效率一致。并且比最近报道的检测蔓枯病菌方法效率高。（3）通过比较检测葫芦科作物上其它7种常见病害，我们开发的方法区分特异性高，可以把蔓枯病菌特异性从葫芦科7种病原（蔓枯病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜链格孢叶斑病菌、葫芦轮枝镰孢菌、西瓜枯萎病菌0号生理小种、西瓜枯萎病菌1号西瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌2号生理小种）和一种同属病原（菜豆褐斑病菌）区分开。由于笔者开发的LAMP方法快速、灵敏、可视化、操作简单，所以对于规模化育苗工厂，苗期早期快速、准确诊断潜病害尤为重要，并且足够满足用于潜在侵染作物和大田检测，所以这一方法对于早期病害诊断和减少病害流行具有重要作用。（4）文献报道加入环引物（loop primer）后反应速度相比未加环引物的标准法只要1/3～1/2的时间，在30 min内就可以获得反应结果。笔者的方法检测速率高与我们设计的引物中加入了环引物（loop primer）有关，但是笔者设计的引物只有loop-backward primer，没有loop-forward primer，所以笔者最佳反应时间是45 min，还有可以提高的空间。

结    论：本研究开发出一种可视化、快速和广谱检测蔓枯病菌的LAMP（环介导等温扩增）方法，具有简单，灵敏和特异性的优点。笔者开发的LAMP方法快速、灵敏、可视化、操作简单，在实际生产中具有多种用途，例如可潜在应用于蔓枯病田间诊断检测和病害控制，瓜类种子检疫，以及在育种过程评价瓜类品种对蔓枯病抗性。该诊断工具的前瞻性应用于早期和准确地诊断葫芦科作物中蔓枯病菌，也可以减少大量杀菌剂的使用，从而有益于保护环境。因此，这项研究代表了开发基于LAMP方法的葫芦科作物早期病害侵染检测系统的成功尝试。