菜用豌豆核心种质构建的关键策略

2019-09-19徐盛春郑华章冯志娟刘娜张古文胡齐赞龚亚明

浙江大学学报（农业与生命科学版） 2019年4期

徐盛春，郑华章，冯志娟，刘娜，张古文，胡齐赞，龚亚明*

（1.浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 310021；2.余姚市农业技术推广服务总站，浙江余姚 315400）

豌豆（Pisum sativumL.）为二倍体（2n＝2x＝14）豆科植物，是世界第二大食用豆类作物[1]。菜用豌豆，也称甜豌豆，属豌豆的专用型品种，主食嫩荚和籽粒，具有极高的营养价值和经济价值，深受消费者喜爱。据统计，我国菜用豌豆产品远销日本、美国、欧洲等地，市场前景广阔。然而，目前菜用豌豆专用品种缺乏，结构单一，已影响了菜用豌豆整体产业的进一步提升，生产上亟须优质、高产菜用豌豆新品种来支撑该产业的发展。而品种选育的重要基础是丰富的种质材料，因此，对菜用豌豆种质资源搜集、鉴定与保存已成为育种工作者的重要工作内容之一。

我国具有丰富的豌豆种质资源，目前已知的达5 000余份[2]，并随着新种质的不断发掘，豌豆种质资源规模日益庞大，给其保存、评价、研究和利用带来了诸多困难，影响了育种效率。因此，构建豌豆核心种质成了研究和利用其遗传资源的便捷途径，对豌豆核心种质的研究也日益受到重视[3]。然而，与其他作物相比，对豌豆核心种质的研究仍较少，特别是针对菜用豌豆类型的核心种质构建及评价方法尚未见报道。

核心种质构建的主要目的是以尽可能少的种质数量，最大限度地代表整个种质群体的遗传多样性[4]；通过对核心种质的优先评价和利用，可提高整个种质资源库的管理和利用水平[5]。然而，目前核心种质构建方法仍处于不断摸索与完善中[6-9]，主要有实测群体农艺性状和计算机模拟群体2大类。虽然计算机模拟在成本节省方面具有一定优势，但实测群体性状数据在遗传多样性方面则更具优势，可真实展现表型性状[10-12]。因此，本研究基于菜用豌豆田间实测群体农艺性状数据，进行核心种质构建方法研究，确定适合菜用豌豆种质资源群体的核心种质构建策略，以期为大规模开展其种质资源研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用180份菜用豌豆种质材料，选择肥水条件一致地块进行播种，每份种质材料随机播种5 m2，行距60 cm，株距30 cm，每穴播种3粒；田间统一管理，鲜荚采收期每份种质随机选择10株进行产量性状测定，包括单株荚数、每荚粒数、豆荚长、豆荚宽、豆荚厚、百荚鲜质量、百粒鲜质量及产量，所测数据用于后续核心种质构建。

1.2 核心种质构建方法

采用最小距离逐步取样（least distance stepwise sampling,LDSS）法构建核心种质[13]。首先，根据取样比例计算核心样品规模；然后，计算群体内各种质样本间的遗传距离并进行聚类分析，寻找遗传距离最小的组，并随机保留一个样本进入下一轮聚类，其余样品去除。对保留的样本重新计算遗传距离并进行聚类分析，用同样的方法对群体进行缩减。继续循环聚类，直到剩余样本数达到取样比例规定的规模，以此构成核心种质群体。

1.3 遗传距离和聚类方法选择

本试验选择5种常用的距离计算方法计算样本间的遗传距离，分别为：欧氏距离（Euclidean distance）、马氏距离（Mahalanobis distance）、曼哈顿距离（city block distance）、夹角余弦距离（cosine distance）和相关系数距离（correlation coefficient distance）。采用非加权组平均法（unweighted pair-group average method）进行聚类，以从原始群体中按一定比例完全随机选取核心样本组成的核心种质作为对照。

1.4 核心种质代表性评价

采用极差符合率（coincidence rate of range,CR）和变异系数变化率（variable rate of coefficient of variation,VR）2个较为有效的常用参数评价核心种质的代表性。计算公式[14]如下。其中：n是数量性状总数，RC(i)是核心种质第i个性状的极差，RI(i)是原始群体第i个性状的极差。，其中：n是数量性状总数，CVC(i)是核心种质第i个性状的变异系数，CVI(i)是原始群体第i个性状的变异系数。

评价标准[14]为：极差符合率不小于80%，核心种质才有代表性。在相同取样比例下，极差符合率和变异系数变化率越大，核心种质的代表性越强。

1.5 数据处理

利用MATLAB环境下的编程，对上述数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 菜用豌豆产量性状鉴定与数据搜集

对参试的180份菜用豌豆种质样本分别进行产量数据鉴定，对单株荚数、每荚粒数、荚长、荚宽、荚厚、百荚鲜质量、百粒鲜质量及产量等性状进行调查。结果（表1）显示，各种质材料间的生物学性状差异显著，其中单株荚数和百荚鲜质量2个指标的变异范围最大，最高值与最低值相差近2倍。而荚长变异范围最小，但最大值与最小值相比，仍高出17%左右。上述结果表明，该批豌豆材料遗传多样性丰富，可有效用于核心种质构建策略研究。

表1 180份菜用豌豆种质田间性状Table 1 Field characters of 180 vegetable pea germplasms

2.2 不同遗传距离和取样比例下菜用豌豆核心种质代表性研究

以上述菜用豌豆种质材料为样本，利用最小距离逐步取样法（LDSS），分别采用不同遗传距离（欧氏距离、马氏距离、曼哈顿距离、夹角余弦距离和相似系数距离）和取样比例（5%～40%）进行核心种质构建，以评价其代表性。结果表明：在5个不同遗传距离计算条件下，核心种质随着菜用豌豆群体取样比例的增大，均表现为CR逐渐增大，趋近于100%；用欧氏距离、马氏距离和曼哈顿距离构建的核心种质，随取样比例的增大，VR总体上呈逐渐减小的趋势（表2）。在相同取样比例下，用欧式距离构建的核心种质的CR和VR最高（极个别除外）；在25%取样比例下，用欧式距离构建的核心种质的CR已超过95%。

2.3 核心种质不同构建策略比较

为进一步了解LDSS方法在欧式距离下构建核心种质的合理性与代表性，将其与完全随机法策略构建的核心种质比较，两者均采用25%取样比例。将上述2种策略构建的核心种质分别进行主成分分析，以第1主成分和第2主成分为坐标轴绘出各样品在群体中的分布图（图1）。结果表明：LDSS方法结合欧式距离在25%取样比例下抽取的核心样品均匀分布于整个群体中，且大部分极端或特殊性状的种质材料入选了核心种质群体；采用完全随机法在同样比例下构建核心种质不仅表现为核心样品分布不均，而且大部分极端样品均未入选核心种质。因此，LDSS方法结合欧式距离在25%取样比例下构建的核心种质具有更好的代表性。为进一步了解核心种质所代表的原始群体特征，对LDSS法结合欧式距离在25%取样比例下的菜用豌豆核心种质及其所代表的原始群体分别进行聚类分析，发现所构建的核心种质并未改变原始群体结构特征（图2）。因此认为，LDSS方法结合欧式距离在25%取样比例下构建的核心种质是合理的。

3 讨论

近年来，菜用豌豆日益受到国内外消费者的喜爱，但由于目前所选用的亲本遗传基础狭窄，较难取得重大突破，致使其育种进程缓慢，制约了豌豆产量和品质的进一步提高。因此，增加豌豆种质资源遗传多样性成为重要措施。但面对不断增加的种质材料，如何对其进行保存和有效利用，同样对育种工作者提出了挑战。因此，利用适宜构建策略获得的核心种质库，可为育种者提供有效的代表种质，提高育种效率。核心种质构建策略主要包括取样方法、取样比例、评价方法等[15]，因作物不同、取样方法不同，其代表性存在差异[16-20]，至今尚未形成一套明确的构建理论以应用于各类作物中。本研究针对豌豆群体遗传背景复杂这一特点，采用LDSS方法取样，以最大限度地去除原始群体中冗余和遗传背景相近的材料，从而构建出代表性强的核心种质。

表2 菜用豌豆核心种质评价参数比较Table 2 Comparison of evaluation parameters of core germplasm for vegetable pea

A.LDSS方法结合欧式距离在25%取样比例下构建的核心种质；B.完全随机法在25%取样比例下构建的核心种质。A.Core germplasms with Euclidean distance combining 25%sampling ratio based on LDSS method;B.Core germplasms with 25%sampling ratio based on completely random method.

图2 菜用豌豆原始群体和核心种质聚类图Fig.2 Cluster map of the original and core germplasms of vegetable pea

核心种质构建质量往往受到遗传距离影响。用欧式距离构建核心种质的有效性已在大豆[21]、郁金香[22]等植物上得到验证。本研究发现，基于欧式距离构建的核心种质，在极差符合率和变异系数变化率上均优于马氏距离、曼哈顿距离、夹角余弦距离和相似系数距离等4类遗传距离，与前期研究[21]一致。同时，合理的抽样比例也是核心种质构建的重要环节。当前，抽样比例研究的主要范围为5%～10%[2-3]，但此类策略容易在一些作物中遗漏最佳取样比例，鉴于此，本试验扩大取样比例范围，为5%～40%。结果表明，采用LDSS方法结合欧式距离构建的菜用豌豆核心种质群体，在10%取样比例下，其极差符合率均已超过80%，可以认为已经构建了有代表性的核心种质[14]。进一步发现，在取样比例较小时，随着取样比例的升高，核心种质的极差符合率急剧升高。然而，在取样比例达到25%以后，极差符合率和变异系数变化率的变化开始减小。因此，本研究认为，选择25%作为最佳取样比例，既能够保证核心种质的高代表性，又兼顾了保存核心种质的经济性。主成分分析也表明：LDSS方法结合欧式距离在25%取样比例下构建核心种质，核心样品均匀分布于整个遗传资源群体中；同时，又极大程度地保留了极端性状的样品入选为核心种质。这类极端性状材料往往可为菜用豌豆遗传改良和优势基因挖掘提供种质基础。