抗抑郁中药材贯叶连翘组培快繁体系建立

姚园园,吕敏,刘学周,黎洁,曹小路,张传继,张真,康天兰,栗孟飞,3

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省经济作物技术推广站,甘肃 兰州 730030；3.甘肃百草中药材种植有限公司,甘肃 兰州 730102)

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，又名圣约翰草(St.John’s Wort)，主要分布于甘肃、陕西、贵州等地，是我国传统中药材，具有抗菌消炎、收敛止血、消肿止痛等功效[1-2].化学分析发现，贯叶连翘地上部分(花、叶和茎)主要含有苯并二蒽酮类化合物(金丝桃素、伪金丝桃素、异金丝桃素等)、黄酮类化合物(芦丁、槲皮素、金丝桃苷等)、间苯三酚类化合物(贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素)、以及挥发油和氨基酸类等化合物[3-5].现代药理学研究表明，以上化合物具有多种生物学活性(抗癌、抗病毒、抗氧化等作用)，尤其金丝桃素在治疗轻度、中度抑郁症方面具有显著效果，使其成为全球研究开发的热点草药之一[4,6-9].

目前，金丝桃素主要从野生贯叶连翘植株中获取，随着市场对金丝桃素的需求与日俱增，使得贯叶连翘野生资源被过度采挖，已不能满足市场需求[10].王亦菲等[11]报道称，2007年全球金丝桃素需求量高达5万t，而当时市场仅能提供2万t.为了解决原料不足的问题，很多学者就人工驯化栽培进行了大量研究[12-14].由于贯叶连翘种子结实率低(约30%)，种子较小(长约1 mm)，到目前为止，还未能实现大面积推广和种植栽培[13-16].因此，利用组培快繁技术解决种苗不足的问题对贯叶连翘大面积种植栽培具有重要意义[17].近年来，很多学者就贯叶连翘组织培养过程中培养基、激素和糖的种类与浓度以及炼苗移栽工作进行了大量研究[17-21]，已初步掌握了贯叶连翘组培快繁技术，然而，对于一个完整组培快繁体系的建立，比如，蔗糖含量、激素种类、培养条件以及炼苗基质等方面的优化选择，还未见系统研究报道.因此，本研究根据贯叶连翘生物学特性，以成熟种子为外植体，进行无菌种子苗的建立和组织培养，旨在为贯叶连翘大面积栽培提供充足的种苗.

1 材料与方法

1.1 试验材料

以贯叶连翘成熟种子为材料，于2016年7月采自甘肃省陇南市康县岸门口镇中节村贯叶连翘种植栽培示范园(N 33°16′20″,E 105°31′50″)，风干后保存于4℃冰箱.

1.2 试验方法

1.2.1 种子灭菌 挑选饱满的种子，自来水冲洗10 min；置于70%乙醇中消毒2 min，无菌水冲洗3次，然后0.1% HgCl2浸泡1 min，无菌水冲洗3次；最后，用无菌吸水纸吸干种子表面水分.

1.2.2 种子发芽诱导的培养基与光照 以MS+4 g/L琼脂为基本培养基(pH 5.8)，考察不同浓度蔗糖、活性炭和光照时间对种子发芽诱导的影响(表1).每个处理接种100粒种子，置于(22±1)℃的光照培养箱中，25 d后统计发芽率.

表1 种子发芽诱导的蔗糖、活性炭浓度与光照时间

1.2.3 地上部分生长诱导的外源激素 以MS+4 g/L琼脂+20 g/L蔗糖+1 g/L活性炭为基本培养基(pH 5.8)，考察6-BA和NAA的不同浓度对地上部分生长诱导的影响(表2).每个三角瓶接种3个1.2.2中种子萌发诱导25 d的茎段，每个处理接种10瓶(30株).置于(22±1)℃的光照(200 lx，24 h/d)培养箱中，30 d后统计地上部分茎节数.

1.2.4 生根诱导的外源激素 以MS+4 g/L琼脂+20 g/L蔗糖+1 g/L活性炭为基本培养基(pH 5.8)，考察IAA、IBA和NAA的不同浓度(0.1、0.5、1.5、2.0 mg/L)对生根诱导的影响.每个三角瓶接种3个1.2.3中地上部分生长诱导30 d的茎段，每个处理接种10瓶(30株).置于(22±1)℃的光照(200 lx，24 h/d)培养箱中，30 d后统计根数与根长.

表2 地上部分生长诱导的外源激素

1.2.5 炼苗基质的选择 以蛭石、泥炭、珍珠岩和腐殖土为炼苗移栽基质，考察不同混合比例(表3)对移栽成活率的影响.选取经生根诱导后生长一致、长势良好的植株，首先在室温下敞口3 d，然后流水冲洗根系表面培养基，移栽至上述混合基质中，每个处理20株.置于日照充足的通风处炼苗，定期浇水，30 d后统计成活率.

表3 炼苗基质的比例

1.3 统计与分析

采用Microsoft Office Excel 2007软件作图，SPSS 17.0软件进行One Way ANOVA Duncan数据差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 培养基与光照对种子发芽诱导的影响

表4结果显示，培养基与光照对种子发芽具有显著影响，蔗糖浓度在10～30 g/L范围内，20 g/L发芽率最高；随着活性炭浓度的增加，种子发芽率显著下降；随着光照时间的延长，种子发芽率显著增加；最终，B处理下：MS+4 g/L琼脂+20 g/L蔗糖+光照24 h/d条件下种子发芽率最高，达到51%，显著高于其它处理.

2.2 外源激素对地上部分生长的影响

表5结果显示，外源激素6-BA和NAA 9种组合下，地上部分茎节间数在B处理下：1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA下最高，其次为A处理下：1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；C处理下：1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA和E处理下：1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA茎节间数最低.

2.3 外源激素对生根的影响

表6结果显示，不同浓度外源激素IAA、IBA和NAA对生根数和根的生长具有显著影响，总体表现为IBA较IAA和NAA更有利于生根和根的伸长，其中，在2.0 mg/L和1.0 mg/L IBA下，生根数和根长分别达到4条和10 cm，均高于其它处理。综合考虑，2.0 mg/L IBA效果较佳，生根数和根长均相对较高，分别达到4条和8 cm。

2.4 炼苗基质对移栽成活率的影响

表7结果显示，基质对组培苗炼苗移栽成活率具有明显差异，其中，B处理下：蛭石∶泥炭=1∶2炼苗成活率最高，达到85%，其次为I：蛭石∶泥炭=1∶1和泥炭∶珍珠岩=2∶1，均达到60%，而K处理下：腐殖土∶珍珠岩=1∶2、N处理下：蛭石∶泥炭∶腐殖土=2∶1∶1和O处理下：蛭石∶泥炭∶腐殖土=1∶2∶2成活率最低，仅为5%。

表4 培养基与光照对贯叶连翘种子发芽诱导的影响 Table 4 Effects of mediums and light on induction of seed germination of H.perforatum

同一因素不同小写字母表示在P<0.05水平下达到显著性差异.

Different lowercases indicate significant differences atP<0.05 level at the same factor.The same below.

表5 外源激素对贯叶连翘地上部分生长的影响Table 5 Effects of exogenous hormones on the growth of aerial parts of H.perforatum

同一因素不同小写字母表示在P<0.05水平下达到显著性差异.

Different lowercases indicate significant differences atP<0.05 level at the same factor.The same below.

表6 外源激素对贯叶连翘生根的影响Table 6 Effects of exogenous hormones on root growth of H.perforatum

同一因素不同小写字母表示在P<0.05水平下达到显著性差异.

Different lowercases indicate significant differences atP<0.05 level at the same factor.The same below.

表7 炼苗基质对贯叶连翘成活率的影响Table 7 Effect of hardening matrix on the survival rate of H.perforatum

3 讨论

植物组织培养在优良种苗繁育、生物技术制药、濒危/珍稀植物保护与利用等方面已得到广泛的应用[22].抗抑郁中药材贯叶连翘的组培快繁对于大面积种植栽培以及野生资源的保护具有重要意义[23].研究已表明，碳源、外源激素种类与浓度、活性炭以及培养环境等在组培快繁中扮演着重要角色[22].

贺军民等[23]和李惠民[24]研究发现，贯叶连翘种子为典型的需光种子，其萌发需要一定浓度的激素(如赤霉素和乙烯利)和光照处理，其中，在125 lx光照强度和200 mg/L赤霉素处理下，种子在培养皿中发芽率达到92%.本研究在MS+4 g/L琼脂+20 g/L蔗糖+光照(200 lx) 24 h/d进行无菌诱导，种子发芽率最高仅为51%；这可能与种子灭菌过程中70%乙醇或者HgCl2消毒时间过长，消毒剂残留抑制种子萌发有关[22].已有学者就外源激素促进地上部茎叶生长进行了研究，发现6-BA和IBA较有利于芽的生长以及茎段形成，其中，茎段离体培养30 d 后，0.5 mg/L 6-BA茎段数达10个[11]，2.0 mg/L IBA茎段数达11个[18]；本研究通过添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭，培养30 d 后，茎段数也达11个.外源激素也对根的生长具有显著影响，茎段离体培养30 d 后，0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA生根率达89%[17]，0.2 mg/L IBA生根率达95%[11]，2.5 mg/L IBA根长约7 cm[18]；本研究结果表明，2.0 mg/L IBA+1.0 g/L活性炭较有利于根的生长，培养30 d 后，根数和根长分别达4条和8 cm.提高试管苗移栽成活率是植物离体快繁的最关键环节[22].而炼苗营养基质不仅影响成活率，而且对植株根的发生与生长以及壮苗至关重要[23-25].就贯叶连翘组培炼苗而言，仅有张东[17]和丁如贤等[20]分别以蛭石∶腐殖土(1∶1)和蛭石∶泥炭(1∶1)为基质进行炼苗，成活率分别为80%和64%；而没有对营养基质进行优化筛选.本研究以蛭石、泥炭、珍珠岩和腐殖土为炼苗基质进行配比优化，结果表明蛭石∶泥炭(1∶2)植株移栽成活率最高可达85%.

4 结论

综合结果表明，在MS+4 g/L琼脂+20 g/L蔗糖+光照(200 lx) 24 h/d的基础上，增殖培养添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭，生根培养附加2.0 mg/L IBA+1.0 g/L活性炭，以及炼苗基质采用蛭石∶泥炭(1∶2)较有利于贯叶连翘的组培快繁(图1).该组培快繁体系的建立将对于贯叶连翘的大规模栽培、金丝桃素生产以及野生资源保护等方面提供理论基础与技术支撑.

A：为外植体种子；B：萌发25 d的种子苗；C：继代15 d试管苗；D：接种的单芽茎段；E：增殖30 d的试管苗；F：炼苗移栽60 d的试管苗植株.A：Images respectively represent explants seeds；B：seedlings germinated after 25 d；C：seedlings sub-cultured after 15 d；D：single-bud stems used for inoculation；E：seedlings proliferated after 30 d；F：plantlets acclimatized and transplanted after 60 d.图1 贯叶连翘组培快繁体系Figure 1 System of tissue culture for rapid propagation of H.perforatum