贯筋藤提取物对小鼠免疫活性的影响

刘威良，姬昱，皮渤淼，苏慧敏，吴白芬，黄艾祥

(云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201)

苦绳(Dregeasinensis)又称小木通、奶浆藤、通关散，属萝藦科南山藤属野生植物资源，广泛分布于中国内陆四川、广西、贵州、云南等地区的山岭地带，现在还未见人工培育的种苗[1].贯筋藤为苦绳的一个变种，广泛分布于云南西北地区的澄江、丽江、大理和昆明等地的灌木丛或山林中[2].贯筋藤浑身是宝，贯筋藤用热水蒸煮浸泡后的溶液，可用来制作云南大理一种特色小吃“乳扇”，其鲜叶、花蕾可与辣椒面、豆豉等风味调料一起搭配烹饪食物[3-4].贯筋藤的干茎是我国傣族医药(傣百解胶囊)的一味药材，用于治疗痈疮疖肿、风湿弊痛、咳嗽痰喘等病症[5].古代医药专著记载贯筋藤可祛风湿止痛、平喘止咳、通经下乳，用以医治风湿痹痛、肺热咳喘、跌打损伤等病症[6-7].研究表明[8-11]，贯筋藤富含黄酮、多糖、甾体皂苷及蛋白质等活性成分，其生理功效有抗抑郁、抗癫痫、抗糖尿病、神经保护、肝保护、免疫调节及抗癌等作用.

目前对贯筋藤的研究多集中于其活性物质的萃取、分离及结构鉴定等方面[12-13].黄艾祥等[14]研究发现，贯筋藤中的蛋白酶类物质是一种天然、高效及安全的凝乳剂，可用于食品加工、工业絮凝剂生产等.但作为一种传统中药材，贯筋藤对体内免疫系统的调节作用还未见报道.目前贯筋藤提取物主要作为一种天然凝乳剂应用于食品工业，其提取凝乳活性物质后残渣仍含有较多生物活性成分及营养物质，直接丢掉会造成资源的浪费，因此，本试验以贯筋藤为研究材料，采用醋酸泼尼松灌胃处理小鼠，建立免疫抑制动物模型，通过灌胃给予正常小鼠及免疫抑制小鼠一定剂量的贯筋藤粗提物，初步考察其提取物对小鼠免疫活性的影响，采用小鼠碳粒廓清实验，测定廓清指数、吞噬指数、免疫器官(胸腺和脾脏)质量等生化指标的变化，旨在初步探究贯筋藤提取物对小鼠免疫活性的调节情况，为其在医疗保健领域的利用及高附加值产品研发提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 贯筋藤鲜茎采自云南丽江永胜县，海拔1 500～3 500 m灌木丛或山林中.

1.1.2 试验动物 SPF级昆明种小鼠，雄性，体质量(18～22 g)，采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(湘)2016-0002.

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试剂 醋酸泼尼松(批号20180518)，浙江仙琚制药股份有限公司；印度墨水(批号20180512)，Solarbio生化试剂公司；羧甲基纤维素钠(批号F20170909)，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇(分析纯，批号20180925)，天津市风船化工股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯.

1.2.2 仪器与设备 Thermo1500全波长酶标仪(芬兰雷勃公司)；RE520旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；Scientz-500C多功能恒温超声萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；CP153电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；LC-162C海尔冰箱(青岛海尔集团).

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备 贯筋藤及料渣醇提物：称取1 kg贯筋藤干茎，粉碎，加入70%乙醇，料液比为1∶10，超声提取(功率600 W，25 ℃，工作间歇比2 s/2 s)30 min，用纱布过滤，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，真空冷冻干燥备用；称取1 kg贯筋藤干茎，洗涤敲断后于20倍水中浸泡(60 ℃，30 min)提酶后得料渣，放烘箱50 ℃烘干后同法制备料渣醇提物，用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成悬浮液[16-17].

1.3.2 动物分组及剂量 按人用药生药量折算为小鼠灌胃剂量，将78只小鼠按体质量随机分为空白、泼尼松、贯筋藤醇提物、料渣醇提物、贯筋藤醇提物+泼尼松、料渣醇提物+泼尼松6组，确保组间体质量无显著性差异(P>0.05)，每组13只，各组均灌胃给药，空白组给予同等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液；模型组即醋酸泼尼松组除给予一定体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，还给予一定剂量的醋酸泼尼松，且两者给药时间间隔至少为4 h.小鼠连续灌胃14 d后开始试验，给药期间观察各组小鼠精神状态、皮毛色泽、饮食与粪便有无异常.

1.3.3 鼠免疫抑制模型的建立 参考文献[17-18]方法并改进.采用醋酸泼尼松(10 mg/kg)连续灌胃给药，致使小鼠免疫器官(胸腺和脾脏)萎缩，建立小鼠免疫抑制模型.连续给药数天后，与空白组相比，模型组体质量有减小的趋势且具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；计算胸腺、脾脏指数，与空白组比较，小鼠免疫器官指数有明显降低趋势且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，表明造模成功.

1.3.4 小鼠碳粒廓清试验 小鼠连续给药14 d后，禁食不禁水，于末次给药后30 min，立即尾静脉注射20%的印度墨汁(0.1 mL/10 g)，分别于2、12 min时眼眶取血20 mL，立即溶于2 mL且浓度为0.1%的 Na2CO3溶液中摇匀，置于波长为680 nm处比色，测定其OD值，并计算廓清指数K值[20].计算公式为：

K=(lgOD2-lgOD12)/(T12-T2)

式中：OD2、OD12为不同时间期取血样的光密度值，T12-T2为所取血样间隔的时间差[20].

1.3.5 小鼠吞噬指数及脏器指数的测定 小鼠取血完成后，脱颈椎处死取肝、脾脏及胸腺，用滤纸吸干其表面血渍，并精确称质量，计算脾脏指数、胸腺指数与吞噬指数( α)[21].计算公式为：

α=K1/3×体质量/(肝质量+脾质量)

胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g)

脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)

2 结果与分析

2.1 贯筋藤醇提物对小鼠体质量的影响

给药期间，各组小鼠毛色有光泽，活泼好动，状态较好，未出现不良反应.与初始体质量相比，贯筋藤醇提物、料渣醇提物及空白组体质量均有增长趋势，组间体质量无统计学差异(P>0.05)；泼尼松、贯筋藤醇提物+泼尼松及料渣醇提物+泼尼松组体质量亦有增长趋势，组间无统计学差异(P>0.05)，但与空白组比较，给药后第14天，泼尼松、贯筋藤醇提物+泼尼松及料渣醇提物+泼尼松组体质量有显著降低趋势且具有统计学差异(P<0.01)，结果见表1.

2.2 贯筋藤醇提物对小鼠免疫器官质量的影响

本研究显示，连续灌胃给药14 d后，贯筋藤及其料渣醇提物与空白组比较，明显增加小鼠的胸腺和脾脏指数，且有统计学差异(P<0.05)；与泼尼松组比较，经贯筋藤提取物干预后免疫抑制小鼠胸腺与脾脏指数均显著升高，且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；泼尼松、贯筋藤醇提物+泼尼松及料渣醇提物+泼尼松组与空白组比较，胸腺和脾脏指数明显降低且有统计学差异(P<0.01)；空白、贯筋藤醇提物及其料渣醇提物组与模型组比较，胸腺和脾脏指数明显高于模型组且有统计学差异(P<0.01)，结果见表2.

表1 贯筋藤醇提物对小鼠体质量的影响

与空白组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与泼尼松比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01.

Compared with control group，“*”indicate the significant differences(P<0.05)，“** ” indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with model group，“#” indicate the significant differences(P<0.05)，“##” indicate the significant differences(P<0.01).

表2 贯筋藤醇提物对小鼠免疫器官质量的影响

与空白组比较，*表示P<0.05,**表示P<0.01；与泼尼松组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01.

Compared with control group， “*”indicate the significant differences(P<0.05)，“** ” indicate the highly significant differences(P<0.01)；Compared with model group，“#” indicate the significant differences(P<0.05)，“##” indicate the highly significant differences(P<0.01).

2.3 贯筋藤醇提物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

本研究显示，连续灌胃给药14 d后，贯筋藤及其料渣醇提物与空白组相比，均能提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数，且有统计学差异(P<0.05)；与泼尼松组比较，免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬指数明显提高，且具有统计学意义(P<0.05)；空白组、贯筋藤醇提物、料渣醇提物组与泼尼松比较，空白组吞噬指数略高于泼尼松组，后两者吞噬指数明显高于泼尼松组且有极显著性差异(P<0.01)，空白组无统计学差异(P>0.05)；贯筋藤醇提物+泼尼松、料渣醇提物+泼尼松组与空白组比较，贯筋藤提取物干预后吞噬指数有所提高但无统计学差异(P>0.05)，结果见表3.

表3 贯筋藤醇提物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

与空白组比较，*表示P<0.05,**表示P<0.01；与泼尼松组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01.

Compared with control group “*”indicate the significant differences(P<0.05)，“**”indicate the highly significant differences(P<0.01)；Compared with model group“#” indicate the significant differences(P<0.05)，“##” indicate the highly significant differences(P<0.01).

2.4 贯筋藤醇提物对小鼠巨噬细胞廓清功能的影响

研究表明，连续灌胃给药14 d后，贯筋藤及其料渣醇提物与空白组相比，均能提高小鼠巨噬细胞的廓清指数，且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；与泼尼松组比较，免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬指数明显提高，且有统计学差异(P<0.05)；空白组、贯筋藤醇提物、料渣醇提物组与泼尼松组比较廓清指数明显高于后者且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；贯筋藤醇提物+泼尼松、料渣醇提物+泼尼松组与空白组比较，经过贯筋藤提取物干预后廓清指数有所提高但差异不显著(P>0.05)，结果见表4.

表4 贯筋藤醇提物对小鼠巨噬细胞廓清功能的影响

与空白组比较，*表示P<0.05,**表示P<0.01；与泼尼松组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01.

Compared with control group “*”indicate the significant differences(P<0.05)，“**”indicate the highly significant differences(P<0.01)；Compared with model group“#” indicate the significant differences(P<0.05)，“##” indicate the highly significant differences(P<0.01).

3 讨论

人体的免疫功能是由免疫分子、免疫器官和免疫细胞等组成的系统共同参与并执行，是机体的一种保护性生理反应，能够辨识自身并对抗外来物质[21].免疫有特异性与非特异性之分，前者是指在有外来抗原物质如细菌、病毒等入侵机体时，发生一系列抗原-抗体呈递反应，激活免疫系统来解除危机，是一种获得性免疫；而后者为一种与生具有的天然性免疫，是人体防御系统的第二道防线[22].研究表明，评价机体免疫效应的“黄金标准”之一是计算免疫器官(胸腺与脾脏)的脏器指数[23].研究还表明，单核巨噬细胞的吞噬能力可以衡量机体非特异性免疫功能，具体表现在吞噬指数，廓清指数的高低水平[24].

有研究发现[25]，一些植物提取物具有免疫调节功效，如野生仙人掌多糖提取物可通过调控小鼠B、T淋巴细胞的增殖活力，发挥特异性免疫调节功能.有研究报道指出[26]，地锦草水煮液能通过调节小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能来发挥其非特性免疫效应.环磷酰胺作为一种广谱的抗癌药物，对多种肿瘤有一定抑制作用，同时众多临床实验表明其亦能通过抑制细胞增殖来减弱机体的免疫功能，所以常应用于免疫抑制模型的建立[27].醋酸泼尼松作为一种肾上腺皮质激素类药物，具有抗炎、抗风湿、抗过敏、免疫抑制等药理功效，相关研究报道指出其可通过诱导淋巴细胞和白细胞的数量降低发挥免疫抑制作用，临床上常用于治疗自身免疫疾病[28].以上两种用于小鼠免疫抑制造模的化学药物均可建立小鼠免疫抑制模型，在所建立的免疫抑制模型中，各指标对两种药物的敏感性有所差异，环磷酰胺对免疫系统的影响较为复杂，并非仅为抑制作用，结果更依赖于给药剂量和检测时限[29].有学者指出，醋酸泼尼松、地塞米松等糖皮质类激素药物与环磷酰胺相比，前者偏向于抑制细胞免疫，后者利于体液免疫抑制模型的建立[30].考虑实验免疫模型的建立应根据需要选择合适的造模剂，醋酸泼尼松成本相对较低，免疫抑制模型建立操作简便，因此本研究采用醋酸泼尼松连续灌胃小鼠复制小鼠免疫抑制模型，通过观察记录泼尼松组与空白组体质量变化，计算胸腺、脾脏指数，与空白组相比，模型组体质量明显下降且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，胸腺、脾脏指数显著降低且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，则认为模型复制成功.

本研究数据表明，连续灌胃14 d后，第14天与空白组比较，模型组(泼尼松组)小鼠体质量差距明显且有统计学差异(P<0.01)；胸腺与脾脏指数明显降低且有显著性差异(P<0.01)，同时廓清指数显著下降(P<0.05)，综上可认为本试验所建立的小鼠免疫抑制模型是成功的.试验结果显示，连续灌胃给药14 d后，贯筋藤提取物均能明显提高正常免疫小鼠的胸腺、脾脏指数及巨噬细胞吞噬能力，且均有显著性差异(P<0.05)；对免疫抑制小鼠免疫器官(胸腺和脾脏)指数，巨噬细胞的吞噬能力有显著增加作用，且有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与空白组比较，模型组小鼠吞噬指数、廓清指数均有所降低，仅廓清指数有显著性差异(P<0.05)，这可能与老鼠个体差异及所用醋酸泼尼松剂量有关，尚需作进一步研究.由此可知，适宜剂量的贯筋藤提取物对醋酸泼尼松引起的脾脏和胸腺萎缩有一定程度的缓解作用，对机体非特异性免疫调节有一定促进作用.

本研究数据显示，贯筋藤提取物在5 g/kg剂量下对免疫抑制小鼠的免疫功能有促进作用，同时亦能提高正常小鼠的免疫功能，这使免疫低下者机体免疫功能得到改善，提高防御疾病的能力，但对于一些具有自身免疫疾病且免疫低下的患者来说应该慎用.大量研究报道证明[31]，植物多糖提取物对免疫功能有很大提高作用，贯筋藤提取物富含多糖、黄酮、皂苷等生物活性成分，推测其发挥功效的主要活性成分是多糖类物质，后期研究需提取出多糖类物质进行更深入的研究.

综上所述，贯筋藤作为一种药食兼用的野生植物资源，富含多种生物活性物质对机体表现出多种功效，本试验研究表明其提取物对正常小鼠及免疫低下小鼠的免疫功能有一定增强作用，作用机制可能与其所含黄酮、多糖等活性成分作用于免疫系统多靶点、多途径调节有关，有待深入研究.由于保健食品不同于药品，其生物活性低、起效慢，需要长期作用才可能产生一定功效，因此所建立的免疫抑制动物模型不能过于严重而超过保健食品的调节范围，后期将采用醋酸泼尼松和环磷酰胺复合造模，筛选最优剂量、检测时限，减少试验误差，在前期基础上对特异性体液及细胞免疫进行系统的研究.本文初步探讨了贯筋藤提取物对免疫活性的影响，希望为其开发成为保健品及药品提供科学依据，也为其料渣资源的高效合理利用提供途径.