苏云金芽孢杆菌对PAHs的降解研究

2019-09-18雒晓芳陈丽华夏苗苗许淑娟熊梅

生物技术通报 2019年9期

雒晓芳陈丽华夏苗苗许淑娟熊梅

（1. 西北民族大学实验教学部，兰州 730030；2. 西北民族大学化工学院，兰州 730030；3. 西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是石油、煤、烟草、各种木材，以及有机高分子化合物等不完全燃烧或在还原条件下经热分解所产生的高毒性、挥发性化合物，是主要的环境和食品污染物［1-3]。这些污染物进入土壤之后会经历极其复杂的化学变化，长此以往，将对土壤的正常结构、生态平衡造成极大的危害［4-5]。PAHs根据苯环数量可分为低环和高环（苯环≥4）PAHs 两类，有研究发现，随着苯环数量的增多，其毒性就越高，生物可利用性越差，越不易被降解［6]。此外，若PAHs存在于环境中的时间越长，其遗传毒性也会增强，所以及时处理环境中此类污染物尤为重要。

PAHs在自然界中存在着生物水解、光作用裂解、降解等消除方法［7]，使得环境中的PAHs含量始终保持着一个动态的平衡［8-9]。然而近几年来，人类生产活动的加剧，使环境中的动态平衡遭到很大破坏，环境中的PAHs大量增加。所以多环芳烃的降解方法已成为了我们现在研究的热题。多环芳烃的去除手段主要有3种：一是直接使用物理措施如加热挥发、混凝沉淀法、填埋和吸附等；二是化学办法如光氧化、化学药剂氧化及臭氧氧化等；三是生物处理法［1]。而对于多环芳烃的降解现在采用得最多的则是微生物处理法。微生物处理降解多环芳烃适用范围广、成本低，工业化程度较高，并且研讨较多，现已被很多工厂利用，特别是有机污染物废水处理厂。微生物具备较强的分解代谢能力和较高的代谢速率，且微生物品种多样化，许多细菌、真菌、藻类如假单胞菌属（Pseudomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、诺卡氏菌属（No-cardia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、微球菌属（Micrococcus）等［10-13]都具有降解多环芳烃的能力。其中在环境土壤中发挥主要贡献的是细菌［14]。修复 PAHs 污染已成为当前国内外环境科学界的共同话题和主攻热点，利用微生物降解PAHs是当前控制土PAHs 污染的主要途径。目前国际上很多学者正在致力于多环芳烃降解菌的筛选工作，可以降解四环及四环以上 PAHs的微生物主要有田头菇属（Agro-cybe）、芽孢杆菌（Bacillus）、布克氏菌属（Burkholderia）、黄杆菌属（Flavobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、副球菌属（Paracoccus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、寡养食单胞菌（Stenotrophomonas）等［15]。童乐等［16]利用秸秆做载体固定混合菌剂降解多环芳烃发现，其降解率较单纯投加菌液或菌液与秸秆简单混合有明显提高。另外，菌体的疏水性是生物修复中的一个决定性因素，是影响细菌吸收和疏水性物质降解的重要因素［17]。

蒽（Anthracene）、芘（Pyrene）、芴（Fluorene）、萘（Naphthalene）、菲（Phenanthrene）等是目前研究PAHs 微生物降解机制的常见环境污染物的模式化合物［7]。响应面法（Response surface methodology，RSM）是在多因素数量处理实验的分析中，分析试验指标（因变量）与多个试验因素（自变量）间的回归关系，而这种回归可能是曲线或者曲面的关系［18-19]。本研究主要是探讨苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）在不同温度、pH、PAHs质量条件下对蒽芘芴这3种化合物的降解特性，并利用响应面设计的方法以温度、pH、PAHs质量为自变量，降解率为响应值分析各因素之间的交互作用，分别筛选出降解蒽、芘、芴的最优条件，为 PAHs 污染环境的微生物修复提供资源保障和科学依据。。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称BT），由西北民族大学实验教学部微生物学实验室保存。

1.1.2 主要药品蒽、芘、芴，红四氮唑（TTC），Tris碱，甲苯（分析纯），环己烷（分析纯），浓硫酸，浓盐酸，凡士林，活性炭等。

1.1.3 仪器 KRQ-400P智能型人工气候箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；S.SW-CJ-2F净化工作台（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 方法

1.2.1 菌种复活将苏云金芽孢杆菌接种于营养琼脂斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱培养48 h后待用［20]。

1.2.2 菌悬液的制备在无菌条件下，将前期复壮的苏云金芽孢杆菌接种于灭菌后的营养肉汤培养基中，包装后置37℃恒温培养24 h备用［21]。

1.2.3 单因素实验设计从温度，pH，PAHs质量3个自变量入手，研究其对苏云金芽孢杆菌降解蒽芘芴的影响。

1.2.3.1 温度梯度设定及实验方法根据芽孢杆菌的最适生长温度范围是30-38℃［22]，故选择单因子试验30、32、34、36及38℃五个梯度。

1.2.3.2 pH梯度设定及实验方法根据查阅文献了解到苏云金芽孢杆菌生长的最适pH为7-8［22-23]，所以设定pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0五个梯度。

1.2.3.3 PAHs质量梯度设定及实验方法根据苏云金芽孢杆菌降解的质量百分数为0.5-2 g/L［24]，故设计单因子试验的梯度0.3、0.5、0.7和0.9 g/L 四个梯度试验。

1.2.4 多因素实验设计在单因素实验基础上，利用Box-Behnken实验设计原理以温度，pH，PAHs质量3个因素为自变量，降解率为响应值设计三因素三水平的响应面实验，每组实验重复3次。根据实验结果进行方差分析以及响应面分析，从而优化实验模型。响应面设计因素与水平如表1。

表1 试验因素与水平

1.2.5 模型验证通过响应面法优化苏云金芽孢杆菌降解蒽、芘、芴的条件，并以优化后的条件参数进行验证实验，比较模型预测值和实验值，从而验证模型的有效性。

2 结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 温度单因子条件下苏云金芽孢杆菌对蒽芘芴的降解率影响由图1可知，在温度的影响下，苏云金芽孢杆菌对芴的降解率随温度的升高而呈逐渐上升趋势，但在34℃之后降解率升值减缓；对蒽的降解率的影响不太明显，作用曲线比较平缓，说明在温度因素影响下苏云金芽孢杆菌降解蒽的变化不大；而对芘的降解率的影响则出现了两重性，温度在30-34℃间降解率上升不明显，但超过34℃时降解率明显下降。由此可以得出苏云金芽孢杆菌对芘的降解率最佳温度是在34℃左右；在相同温度影响下，苏云金芽孢杆菌对蒽的降解率要比对芘和芴的降解率都高。对芘和芴作用在36℃左右出现交叉点。

2.1.2 pH单因子条件下苏云金芽孢杆菌对蒽芘芴的降解率影响据图2分析，在同一pH值影响的条件下苏云金芽孢杆菌对各物质降解作用的影响也存在不同。苏云金芽孢杆菌对蒽的作用曲线从pH在5-7时呈逐渐上升趋势，而pH在7-9时却有明显下降趋势，说明pH7时，苏云金芽孢杆菌对蒽的降解率最大；而苏云金芽孢杆菌对芘的降解作用曲线在pH7之前，随pH的增大而上升，pH在7-8时下降幅度比pH在8-9时的下降幅度大，苏云金芽孢杆菌对芘的作用曲线在pH8之后可能有回升的趋势，但pH在5-9范围内，苏云金芽孢杆菌对芘降解率最大时的pH与物质蒽一致，均为pH7。在pH单因素影响下，苏云金芽孢杆菌对芴的降解率呈不断升值状，但在pH7前后上升趋势有所不同。在相同pH下，苏云金芽孢杆菌对蒽、芘的降解率较对芴的降解率高很多。

图2 不同pH条件下苏云金芽孢杆菌对3种物质的降解

2.1.3 PAHs质量单因子条件下苏云金芽孢杆菌对蒽芘芴的降解率影响从图3整体来看，分别就3个不同物质来说，苏云金芽孢杆菌降解蒽、芘、芴具有同步性，即随着PAHs质量的增加，其降解率都在逐渐下降，且呈持续下降的趋势，只是3种物质的下降幅度不同，对蒽和芘来说下降比较缓慢且两者降解率在数值上相差不大，而对芴来说，下降坡度大，说明所用蒽、芘、芴的量越少，其被降解的效果就越佳，这对芴的作用相对另两种物质更为明显。在增加PAHs质量为0.9 g时，苏云金芽孢杆菌对芴的降解率已经下降到27.63%。从图3可以看出，苏云金芽孢杆菌对蒽和芘的降解率在PAHs质量为0.9 g时最小，但其最小降解率比芴的最大降解率要大，说明同等PAHs质量条件下苏云金芽孢杆菌对蒽和芘的降解率均高于芴。

图3 不同PAHs质量条件下苏云金芽孢杆菌对3种物质的降解率

2.2 多因素实验结果

2.2.1 蒽三水平因子设计与结果

2.2.1.1 蒽响应面设计结果根据单因素实验结果，选择温度32℃、34℃、36℃，pH6.0、7.0、8.0，PAHs质量 0.3 g、0.5 g、0.7 g 三因素三水平，利用Box-Behnken设计实验如表2。

2.2.1.2 模型的建立及显著性检验与误差分析根据表2中的数据可知：温度为32.00℃，pH为7.00，PAHs质量在0.30 g时降解率达到最大值99.70%；温度为34.00℃，pH为6.00，PAHs质量为0.70 g时，降解率最小为51.65%。利用 Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken进行回归分析，得到苏云金芽孢杆菌对蒽降解率的二次模型为：

对该模型进行回归方程系数显著性分析见表3，误差分析见表4。回归模型P=0.000 6＜0.01 极显著，表明该模型具有统计学意义。失拟项P=0.104 3＞0.05不显著，说明外来因素对实验的影响很小。决定系数R2=95.66%，R2adj=90.07%，说明响应值的变化有95.66%是来源所选的变量［25]。精密度（Adeq precision）=12.438 7，是有效信号与噪音的比值，说明实验模型合理［26]。

表2 蒽三水平因子实验设计及结果

表3 回归方程方差分析

2.2.1.3 响应面交互作用分析根据回归模型，本实验选取交互效果最好的曲面图和等高线图。将PAHs质量固定，可以得到温度和pH两因素交互作用的响应面图及对应等高线图，如图4反映了温度和pH两因素交互对降解率的影响显著，表现为其等高线为椭圆形，且响应面曲线走势陡。3D图上的最大响应值在曲面上，与沿着某一因素坐标轴走向的最大值不重合，表明温度、pH两因素之间有交互影响。由响应面曲线图可以看出在pH为7.0-7.5，温度在35.0-36.0℃时苏云金芽孢杆菌对蒽的降解率最高，能达92%左右。

表4 回归方程误差统计分析

图4 温度和pH交互影响苏云金芽孢杆菌降解蒽的响应面图及等高线图

2.2.1.4 实验结果优化根据实验设计，得到降解蒽的优化条件为温度35.53℃，pH为7.16，PAHs质量0.30 g，降解率预期可达92.13%。

2.2.2 芘三水平因子设计与实验结果分析

2.2.2.1 芘响应面设计结果根据单因素实验结果，选择温度32、34和36℃，pH6.0、7.0、8.0，PAHs质量0.3 g、0.5 g、0.7 g 三因素三水平利用Box-Behnken设计实验如表5。

表5 芘三水平因子实验设计及结果

2.2.2.2 模型的建立及显著性检验根据表5中的数据降解率在温度为34.00℃，pH为6.00，PAHs质量在0.30 g时达到最大值95.32%。而在温度为36.00℃，pH为7.00，PAHs质量为0.70 g时，降解率最小为79.16%。利用 Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken进行回归分析，得到苏云金芽孢杆菌对芘降解率的二次模型为：

对该模型进行回归方程系数显著性分析见表6，误差分析见表7。回归模型P＜0.000 1＜0.01极显著，表明该模型具有统计学意义。失拟项（P=0.135 7＞0.05不显著，即该模型在被研究的整个回归区域内拟合较好，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。决定系数R2=97.40%，R2adj=94.05%＞80%，说明响应值的变化有97.40%是来源所选的变量，且只有5.95%的变异能由该模型解释。说明各试验因素与响应值之间线性关系显著，试验方法可靠。精密度（Adeq precision）=18.021 1，说明实验设计合理。因此，该回归方程可以描述各因素对苏云金芽孢杆菌降解芘的影响，可利用该响应面近似模型进行后续的优化设计。模型中B、C、AC、BC、A2、B2、C2（P＜0.01），说明 pH、PAHs质量及两者的二项式、PAHs质量与温度、pH交互项、温度二项式具有极显著影响，A、AB（P＞0.05），说明温度、温度与pH交互影响不显著，表明实验因素对响应值是一种非线性关系。

表6 回归方程方差分析

表7 回归方程误差统计分析

2.2.2.3 响应面交互作用分析根据芘的回归模型，选取将PAHs质量固定在一定水平，温度和pH两因素交互作用的响应面图及对应等高线图。图5反映了温度和pH两因素交互对降解率的影响显著性不是很理想，表现为其等高线偏离椭圆形，响应面曲线走势较陡，可从3D图上中找到最大降解值。由响应面曲线图可以看出在pH为6.0-7.0，温度在34.0-35.0℃苏云金芽孢杆菌对芘的降解率最高，能达86%左右。

图5 温度和pH交互影响苏云金芽孢杆菌降解芘的响应面图及等高线图

2.2.2.4 实验结果优化根据实验设计，得到降解芘的优化条件为温度35.69℃，pH为6.16，PAHs质量0.30 g，降解率预期可达87.08%。

2.2.3 芴三水平因子设计与实验结果分析

2.2.3.1 芴响应面设计结果根据单因素实验结果，选择温度32、34和36℃，pH 6.0、7.0、8.0，PAHs质量0.3 g、0.5 g、0.7 g 三因素三水平利用Box-Behnken设计实验如表8。

2.2.3.2 模型的建立及显著性检验根据表8中的数据降解率在温度为36.00℃，pH为6.00，PAHs质量在0.50 g时达到最大值89.71%。而在温度为32.00℃，pH为7.00，PAHs质量为0.70 g时，降解率最小为41.46%。利用 Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken进行回归分析，得到苏云金芽孢杆菌对芴降解率的二次模型为：

对该模型进行回归方程系数显著性分析见表9，误差分析见表10。回归模型P=0.013 3＜0.05，说明试验所采用的二次模型是显著的，具有统计学意义。失拟项P=0.256 0＞0.05不显著，说明外来因素对实验的影响小，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。决定系数R2=91.65%，R2adj=86.65%＞80%，说明响应值的变化有91.65%是来源所选的变量，拟合度良好。因此，可用来对苏云金芽孢杆菌降解芴的研究进行初步分析和预测。模型中AC（P＜0.01），说明温度与PAHs质量的交互项具有极显著的影响，A、C、AB、A2（P＜0.05），温度、PAHs质量、温度与pH交互项、温度二项式对苏云金芽孢杆菌降解芴影响显著。

表8 芴三水平因子实验设计及结果

表9 回归方程方差分析

表10 回归方程误差统计分析

2.2.3.3 响应面交互作用分析根据回归模型，选取将pH固定在一定水平，温度和PAHs质量两因素交互作用的响应面图及对应等高线图。等高线近椭圆，反映了温度和PAHs质量两因素交互对降解率的影响显著。在回归方程中，二次项系数为负，所表现为响应面曲线走势较陡，开口向下，可以确定最大降解率。由图6可知，在温度为34.0-35.0℃，PAHs质量为0.4-0.5 g时，苏云金芽孢杆菌对芴的降解率达到最大值83%左右。

图6 温度和PAHs质量交互影响苏云金芽孢杆菌降解芴的响应面图及等高线图

2.2.3.4 实验结果优化根据Design Expert Box-Behnken design中Optimization，得到降解芴的优化条件为温度34.91℃，pH为7.17，PAHs质量为0.40 g，降解率预期可达83.56%。

2.3 验证实验

同多因素实验方法，分别进行3个物质的最后验证试验（表11）。将实际的实验结果与响应面设计分析所得的预测实验结果进行对比，计算相对误差，从而判断优化模型是否合理。

表11 模型验证

在验证试验中，降解蒽的优化条件为温度35.53℃，pH为7.16，PAHs质量0.30 g，降解率预期可达92.13%。经验证试验得实际值为91.60%，相对误差在±0.58%，说明该优化的实验模型有效性高，能够有效预测苏云金芽孢杆菌对蒽的降解情况。降解芘的优化条件：温度35.69℃，pH为6.16，PAHs质量0.3 g，降解率预期可达87.08%。实际试验值为86.62%，相对误差在±0.53%。相对误差在±2%以内，即可以说明该实验模型的有效性。降解芴的优化条件为温度34.91℃，pH为7.17，PAHs质量0.40 g，降解率预期可达83.56%，与实际试验值82.95%相对误差为±0.73%。3个优化实验模型的相对误差均在±2%以内，说明33个模型有效性高，表明3个模型均能有效反映苏云金芽孢杆菌在各自条件下对3种物质的降解。

3 讨论

当蒽、芘及芴的浓度达到 0.9 g/L 时，苏云金芽孢杆菌对其三者的降解效果明显降低，这可能是由于有毒有害的代谢产物在高浓度芘降解过程中积累，对微生物的生长及对3种物质的利用产生了一定的抑制作用。陈晓鹏等［27]和Lu等［28]的相关研究也表明，微生物在降解芘的过程中，降解效果随着芘初始浓度的升高而降低。

另外，响应面方法RSM 也是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，是数学方法和统计方法结合的产物，已被广泛应用到微生物培养基优化中，但以响应曲面法来优化芘共代谢降解条件的研究比较少。因此，本次实验主要利用Design Expert 8.0.6.1软件中的Box-Behnken设计版块对前期实验进行设计以及对实验结果进行了方差分析以及对实验模型进行了优化。在多因素实验中，不同物质在不同条件交互影响下降解效果不同。对于蒽物质来说，温度和pH交互作用的响应面曲线较陡，等高线近椭圆且变化较稀疏，说明温度和pH交互项对降解率影响显著；对芘来讲，响应面曲线较陡，等高线偏离椭圆形，说明温度与pH两者的交互作用微弱，表明温度和pH对降解率峰值的影响不太大；对于芴，温度与PAHs质量两因素交互作用对降解率的影响显著。且从回归方程可见，各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，二次项和交互项对响应值都有很大关系。因为回归方程中各项系数绝对值的大小也直接反映各因素对响应值影响程度，系数的正负反映了影响的方向［29]。残差分析是借助图形分析工具进行评价的，残差分析可以诊断响应面优化模型的正确性［30-31]，正确合理的模型要求残差呈正态概率分布且误差方差齐性检验合理. 此方面与国外微生物菌系降解多环芳烃方面的研究较近，具有良好的工业应用前景［32-33]。在验证试验中，3种物质在相应的优化条件下的实际降解率值与响应面预测值的相对误差均在2%以内，说明该优化的实验模型有效性高，表明3个模型均能有效反映苏云金芽孢杆菌在不同条件下对3种物质的降解，并可将此实验模型投入大型实验田中。因此，选用响应面优化分析多种共代谢底物对降解率的影响，可有效提高微生物对难降解有机物的降解率，为治理PAHs 污染土壤提供理论依据。