肾疏宁干预HBV诱导的HK-2细胞转分化及迁徙能力的研究*

杨熙凯，徐 冰，王耀光

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300381；2.天津中医药大学，天津 301617）

乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN），简称乙肝相关性肾炎，中国是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高发地区，HBV-GN的检出率呈逐年上升趋势[1]。目前多认为HBV-GN的发病为HBV直接侵犯肾脏上皮细胞[2]导致，同时肾脏中确定了HBV抗原的表达，并揭示了病毒复制和直接病毒诱导的病理改变[3-4]。当乙肝病毒侵犯肾脏时，会对肾小管上皮细胞造成损伤导致肾小管-间质纤维化的发生[5]，肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（TEMT）是肾间质纤维化的关键过程。肾疏宁是黄文政教授“疏利少阳”学术思想的代表方剂，用于治疗免疫球蛋白A（IgA）肾病[6]、膜增生性肾炎[7]、HBV-GN[8]等肾病，是临床常用方剂，但是本方在治疗HBV-GN的作用机制方面尚不清楚。故本实验使用脂质体转染C基因型重组乙型肝炎病毒（pHY106-HBV）质粒至肾小管上皮细胞，旨在证明HBV质粒可以诱导HK-2细胞发生转分化，而肾疏宁含药血清可以抑制其对HK-2细胞的不良作用。

1 实验材料

1.1 主要仪器与试剂 SANYO MCO-15AC CO2恒温培养箱，SANYO公司；DMED/F12培养基（批号：C11995500BT），Gibco公司；胎牛血清（批号：35-010-CV），Cellgro 公司；Opti-MEM（批号：31985-070），Gibco 公司；lipofectamine 2000（批号：11668019），Invitrogen公司；人乙肝病毒e抗原（HBeAg）酶联免疫吸附实验（ELISA）Kit ELISA（EK0215），SAB 公司；人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）ELISA Kit（EK0216），SAB 公司；Transwell小室（PI342050），Corning公司。

1.2 实验药物 肾疏宁的方剂组成为柴胡15 g，生黄芪 30 g，黄芩 10 g，丹参 30 g，鬼箭羽 30 g，山茱萸12 g，萹蓄15 g，白花蛇舌草30 g，益母草30 g。中药购自天津中医药大学第一附属医院，煎煮后使用旋转蒸发仪浓缩至生药含量为5.512 g/mL。pHY106-HBV及pHY106真核表达载体（不含重组HBV的空载质粒），为北京地坛医院刘顺爱教授惠赠。

1.3 细胞与小鼠 HK-2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；SPF级成年C57BL/6小鼠60只，体质量20～25 g，雌雄各半，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院放射医学研究所。

2 实验方法

2.1 制备含药血清 将小鼠随机分为空白组、肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组，每组15只。根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表换算，肾疏宁高浓度组生药浓度为2.756 g/mL，肾疏宁中浓度组生药浓度为2.034 g/mL，肾疏宁低浓度组生药浓度为1.313 g/mL，以每日每只小鼠0.2 mL/10 g灌胃，空白组灌服同体积生理盐水，灌胃7 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃2 h后予以摘眼球采血，静置后3 000 r/min 4℃离心20 min，取上清，56 ℃水浴箱灭活 30 min，0.22 μm 滤膜过滤除菌，-80℃保存。

2.2 细胞传代 HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。每隔2 d换新鲜培养基1次，培养融合至80%以上，使用胰酶消化，消化后传代培养。实验前，无血清培养基饥饿培养24 h同步细胞，重复实验3次。

2.3 实验分组 收集细胞均匀接种于6孔培养板中，培养24 h后分为6组，分别为：1）空白血清对照组：HK-2细胞用DMEM/F12培养基培养，予10%生理盐水组血清培养。2）空质粒组：将空质粒（pHY106）转染至HK-2细胞，予10%生理盐水组血清培养。3）HBV组：转染HBV质粒（pHY106-HBV）的HK-2细胞，予以10%生理盐水含药血清培养。4）肾疏宁低浓度组：转染HBV质粒的HK-2细胞，予10%肾疏宁低浓度组含药血清培养。5）肾疏宁中浓度组：转染HBV质粒的HK-2细胞，予10%肾疏宁中浓度组含药血清培养。6）肾疏宁高浓度组：转染HBV质粒的HK-2细胞，予10%肾疏宁高浓度含药血清培养。含药血清干预48 h后进行检测。

2.4 质粒转染 观察6孔板中细胞，当达到60%～70%密度时，进行瞬时转染。将2 μg质粒和5 μL Lipofectamine 2000分别加入250 μL Opti-MEM 培养基中，并轻轻混合。室温下静置5 min，将两者混合，室温静置20 min。吸取原有培基，将1.5 mL新鲜DMEM/F12培养基加入每孔。空白血清对照组另加500 μL DMEM/F12 培养基; 将 500 μL lipofectamine 2000-空质粒（pHY106）复合物加入空质粒组。将500μLlipofectamine 2000-HBV质粒（pHY106-HBV）加入HBV组及肾疏宁含药血清组，注意转染时不可加入血清。6 h后换液并分别加入各组对应的含药血清继续培养。

2.5 ELISA法检测HBsAg、HBeAg的表达 按试剂盒说明采用ELISA法检测各组细胞裂解液中HBsAg、HBeAg的含量。

2.6 免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin） 将细胞用4%多聚甲醛固定，并在室温下用0.3%TritonX-100处理20 min。与3%H2O2温育后，在室温下用兔血清封闭细胞30 min。然后分别加入第一抗体 α-SMA（abcam，1∶200 稀释）、E-cadherin（abcam，1∶50 稀释），在4℃下孵育细胞过夜。使用生物素标记的第二抗体在37℃下孵育1 h。在8 min DAB孵育后，用苏木精对细胞进行反染色，随后进行梯度醇脱水，二甲苯透明和树胶密封。每组3个独立样本，每个样本随机取3个视野进行拍照。采用生物医学图像分析系统（Image pro plus）进行图像分析，用平均吸光度表示阳性物质的相对含量。

2.7 Transwell法检测细胞迁徙能力 将Transwell放置于24孔板中并标号，消化细胞，种植于Transwell上室。同时取等量细胞在24孔板中培养作为细胞总量的参考。在下室加入10%胎牛血清（FBS）的培养基以形成营养梯度。培养箱中培养48 h后，去除培养基，用4%的多聚甲醛4℃过夜后取出风干，同时去除24孔板中固定的参照细胞的多聚甲醛并风干。用0.01%的结晶紫染色30 min。清洗后拍照并检测吸光度。

2.8 统计方法 应用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD检验，若数据方差不齐，进行Welch’s anova检验，两两比较采用Games-Howell法进行两两比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HBsAg、HBeAg的表达 空质粒组与空白血清组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；HBV组与空质粒组和空白血清组比较，HBsAg、HBeAg表达上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

3.2 α-SMA、E-cadherin的表达

3.2.1 α-SMA蛋白的表达结果 α-SMA蛋白为上皮细胞表型转化为间充质细胞的标记蛋白，免疫细胞化学法检测α-SMA蛋白，结果如表2，图1所示，空质粒组与空白血清组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与空质粒组比较，HBV组α-SMA蛋白表达明显上调（P＜0.01）；与HBV组比较，肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组α-SMA蛋白表达明显下调（P＜0.01）。HBV组胞质呈棕黄色，而各治疗组胞质棕黄色颗粒表现为不同程度的减少；肾疏宁各干预组组间比较，与肾疏宁高浓度组比较，肾疏宁低浓度组α-SMA蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；肾疏宁中浓度组 α-SMA蛋白表达相对较多（P＜0.01）。

表 1 HBsAg、HBeAg 的表达（x±s）Tab.1 Expression of HBsAg，HBeAg（x±s）

表2 各组细胞α-SMA、E-cadherin蛋白表达结果（x±s）Tab.2 Expression of α-SMA and E-cadherin proteins of cells in each group（x±s）

图1 各组α-SMA表达结果（标尺：19 μm）Fig.1 Expression of α-SMA in each group（scale bar：19 μm）

3.2.2 E-cadherin蛋白的表达结果 E-cadherin蛋白为肾小管上皮细胞间黏性连接蛋白，空质粒组与空白血清组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与空质粒组比较，HBV组E-cadherin蛋白表达下调（P＜0.01）；与HBV组比较，各治疗组有上调E-cadherin蛋白表达的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。HBV组细胞胞浆内棕黄色颗粒减少，E-cadherin蛋白表达降低，其余治疗组较HBV组，其胞浆内棕黄色颗粒均略有增多，但增多不明显。见图2。

表3 各组细胞迁徙能力（x±s）Tab.3 Migration capacity of cells in each group（x±s）

图2 各组E-cadherin表达结果（标尺：19 μm）Fig.2 Expression of E-cadherin in each group（scale bar：19 μm）

3.3 Transwell法检测细胞迁徙能力 应用Transwell法动态观察EMT过程中细胞迁徙能力的变化，以及各治疗药物对细胞迁徙能力的抑制作用。如图3可见，空质粒组与空白血清组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；HBV组与空质粒组比较，因HBV诱导HK-2细胞发生转分化发生EMT，细胞迁徙能力明显增强（P＜0.01）。与HBV组比较，肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组细胞迁徙能力明显减弱（P＜0.01）。肾疏宁各干预组组间比较细胞迁徙能力无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 Transwell法检测各组细胞迁徙能力（标尺：25 μm）Fig.3 Migration capacity of cells detected by Transwell in each group（scale bar：25 μm）

4 讨论

中国乙型病毒性肝炎的发病人数占全球感染乙肝病毒总人数的30%[9]。HBV抗原在肾小管上皮细胞持续表达会介导免疫炎症反应，使肾小管上皮细胞发生表型转化，并向间质纤维化方向发展。

中医并无HBV-GN的病名，根据患者的临床症状和疾病的特点，可归于中医“尿浊”“尿血”“虚劳”“鼓胀”等范畴。黄文政教授在治疗肾病时，使用“三焦网络学说”作为理论指导，疗效甚佳。在治疗HBV-GN时，黄文政教授认为面对HBV-GN水肿、蛋白尿等症状，使用疏利少阳、通畅三焦的方法，调节三焦网络系统，恢复水液正常代谢。同时黄文政教授也认为HBV-GN存在湿热邪毒内蕴脏腑、病情缠绵累及脾肾的病机。所谓毒邪，即湿热、浊毒等，对于西医学而言，则为HBV侵犯人体后的有毒代谢产物、血肌酐、尿素氮等。法当解毒利湿，肝肾亏虚则应当补益脾肾，所以使用黄教授“疏利三焦”学术思想的代表方肾疏宁治疗本病，此方由柴胡、生黄芪、黄芩、丹参、鬼箭羽、山茱萸、萹蓄、白花蛇舌草、益母草组成。方中柴胡疏解少阳枢机，黄芩清解三焦郁火；黄芪补气、山茱萸养阴；白花蛇舌草、萹蓄清热利湿解毒；丹参、鬼箭羽、益母草活血化瘀通络，诸药搭配，疏利少阳，扶正祛邪。

本研究中采用的重组质粒是以中国感染患者的HBV为模板构建，拷贝的C基因型HBV的（含HBV的全基因组）pHY106-HBV，并且C基因型是中国HBV感染患者的多见基因型，具有代表性，它能在细胞内高效复制。当使用HBV质粒转染HK-2细胞时，通过ELISA检测，可以发现HBV有效的复制和表达了相应的抗原，并且通过免疫细胞化学法，也可以发现α-SMA、E-cadherin的变化，此过程中，上皮标志蛋白E-cadherin表达下调，细胞失去上皮细胞特性，细胞之间黏附能力的下降[10]，而肾小管上皮细胞通过发生上皮间质转化（EMT）而转化为成纤维细胞/肌成纤维细胞，其中肌成纤维细胞的标记蛋白α-SMA蛋白表达逐渐增多。同时应用Transwell法观察发现，HBV转染增强了在HK-2细胞的迁徙能力，这无疑是上皮细胞表型以及细胞的骨架蛋白的改变，才导致了细胞迁移能力的增强。综上，HBV转染对HK-2细胞的表型转化确有影响。

而当使用肾疏宁药物干预后笔者发现，肾疏宁各浓度含药血清α-SMA蛋白的表达有明显的抑制作用，并且肾疏宁中浓度组有较好效果。遗憾的是3组药物对E-cadherin蛋白的表达虽然有一定的上调趋势，但并没有统计学意义。由此可知，肾疏宁在干预HBV-GN肾小管上皮细胞表型转化中是以抑制α-SMA为方向，达到减轻肾小管上皮细胞表型转化的目的。已有研究表明，柴胡、生黄芪等药物可抑制α-SMA[11-12]，这些研究从单味药层面对中药的作用进行了阐述，间接证明了肾疏宁的有效性。同时，肾疏宁，虽然对E-cadherin蛋白的作用不明显，但其可以下调细胞的迁徙能力，这可能与中药复方的多靶点作用有关，比如基质金属蛋白酶（MMP）家族对于细胞的迁徙能力就具有重要作用[13]，这也为研究者进一步研究肾疏宁的作用提供了新的方向。故本研究提示，HBV转染HK-2细胞会导致细胞转分化并增强细胞迁徙能力，而肾疏宁含药血清可以减轻由HBV导致的上皮细胞转分化并减弱其细胞迁徙能力，但其具体的机制有待进一步研究。