一株提高植物幼苗耐受Cr6+细菌(Exiguobacterium sp.S2)的分离与鉴定

周晓伦 万建新 王卫卫 张伟 姚彦红 高芸

摘要：植物促生菌因其具有对植物生长促进及增强抗逆性等优点，在植物-微生物联合修复重金属污染土壤中具有良好的应用潜力，能为环境生物修复以及工农业生产提供优良菌种资源，实现其更大范围的应用。以甘肃省平凉市污染土壤中分离得到的Cr6+耐受菌株为目的菌，测定菌株的促植物生长特性（产IAA、溶磷、ACC脱氨酶活性），采用改良的Belimov方法筛选出1株促生特性较好的菌株，进行生理生化及16S rRNA基因序列分析鉴定。初步分离得到32株Cr6+耐受菌株，根据改良的Belimov方法筛选出1株S2菌株，通过生理生化及16S rRNA鉴定S2菌株为Exiguobacterium sp.，GenBank登录号为MH180821。玉米幼苗生长试验表明，与不同Cr6+浓度处理组相比，接种了S2菌株的玉米幼苗根长、茎长、叶面积都有显著提高，平均根长分别增加95.74%、41.34%、194.12%，平均茎长分别增加32.03%、-30.13%、28.96%，平均叶面积分别增加73.94%、35.17%、26.92%，平均鲜质量分别增加33.33%、33.62%、-20.00%，其显著提高了玉米幼苗对Cr6+的耐受性。该研究表明，Exiguobacterium sp.S2在污染土壤中能够更好地定殖并保护促植物生长能力的发挥，为重金属污染土壤的植物-微生物联合原位修复提供了良好的微生物资源。

关键词：玉米幼苗;Cr6+耐受菌株;ACC脱氨酶;吲哚乙酸;微小杆菌

中图分类号： X53;S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0273-05

在过去几十年的工业领域中，大量的使用重金属[铬（Cr）、镍、铜、锌、铅、隔等]导致土壤和地下水污染，对人类健康和生态环境造成重大的威胁。在不同的重金属中，铬是主要的污染物之一，由皮革制革、电镀、采矿、纺织、金属加工、化肥、染料和颜料制造等各种工业应用产生[1]。Cr化合物对植物的毒性很大，不利于植物的新陈代谢。虽然许多植物不受低浓度Cr（3.8×10-4 μmol/L）的影响，但当Cr浓度为 100 μmol/（L·kg）時，对高等植物有毒害[2]。外部环境存在的Cr改变了植物生长发育的格局。已有研究表明根生长的减少是由于树木和植物中的重金属[3]。

文献调查表明，几乎没有人报道植物中铬毒性的改良方法，主要原因在于大多数研究集中于通过树木和植物促进Cr的积累，达到植物修复的作用。Khan报道合欢树、阿拉伯相思树和印度黄檀这些树种的菌根保护它们免受重金属的毒害和制革厂废水铬的污染[4]。Karagiannidis等研究泡囊丛枝菌根真菌（漏斗孢球囊霉）对硬质小麦生长和营养吸收的影响，证实泡囊丛枝菌根真菌（VAFM）能够提高小麦的生物量和减少Cr在植物中的含量[5]。Davies等发现VAFM能够增强向日葵耐受Cr的能力，VAFM对Cr处理植物的组织矿物浓度、生长和气体交换都有积极的作用[6-7]。正如Burd等陈述的，在重金属污染的土壤中重金属含量已经超过了植物的耐受范围，它可能会用根际微生物处理植物以此来增加植物的生物量，稳定和修复被污染环境中的植物[8]。

植物对重金属的耐受与其产生的一种多肽类物质有关，这种物质能够螯合重金属，从而减少重金属对植物根系酶的伤害[9]。植物根的活动可能增加金属、非金属的溶解性，通过酸化、氧化还原反应、分泌金属螯合物或者有机配体与阴离子竞争结合位点[10]。微生物通过产生有机配体，分解土壤中的有机物质或者分泌一些代谢物能够改变金属、非金属之间的转化[11]。土壤菌群和作物根之间相互作用对植物的发育和存活有着不可估量的作用[12]。数个植物相关细菌已被报道能够加速重金属污染的生物修复，通过促进植物生长，在促进植物修复中起着重要的作用[13-14]。这些植物促生菌能够使宿主增长和重金属积累的过程可能包括（1）合成一些化合物[例如吲哚-3-乙酸、吲哚乙酸（IAA）、铁载体、有机酸;1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶];（2）刺激一些代谢途径（例如生物固氮和溶磷）;（3）改变金属在植物中的迁移率和有效性。该研究从3个不同污染地区土壤中分离出32株Cr6+耐受细菌，采用改良的Belimov方法筛选出1株植物促生显著的菌株，通过测定菌株的促生特性（IAA含量、溶磷能力、ACC脱氨酶活性），同时测定其抗重金属能力，并基于16S rRNA基因序列及表型分析鉴定其种属。以期得到一批优良的土著植物促生菌，为进一步利用微生物-植物联合修复重金属污染提供一批微生物资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究中使用的所有化学药品等级均为分析纯，由西安姚北生物科技有限公司提供。Cr6+的储备溶液（1 000 mg/L）：将2.829 g重铬酸钾（K2Cr2O7）溶于1 L无菌蒸馏水中，进一步稀释至工作浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 Cr6+耐受菌株的分离 采用梅花法收集3个不同污染地区距地表15 cm的土壤：（1）甘肃省平凉市庙底下村（106.894074°E、35.49297°N）;（2）甘肃省平凉市庙底下村（106.897003°E、35.490824°N）;（3）甘肃省平凉市二十里铺村（106.783376°E、35.508361°N）。准确称取3个不同地区土壤各10 g，分别加入盛有90 mL无菌水（含有25～35个玻璃珠）的锥形瓶中，置振荡器上振荡15 min，得到10-1浓度的土壤稀释液，连续稀释至10-11，将10-1～10-11梯度的土壤稀释液均匀地涂布于含有100 mg/L Cr6+的LB培养基中，（35±2） ℃倒置培养3～5 d。挑取形态特征不同的菌落划线至含有100 mg/L Cr6+的LB培养基中继续培养，每种菌株连续纯化3代以上，最终使平板上的菌落形态和镜检的菌体形态一致，将纯化的菌落划线至牛肉膏蛋白胨琼脂斜面，4 ℃保藏，以备后续研究。共分离出32株Cr6+耐受细菌，其中菌株S2能显著地提高玉米幼苗对Cr6+的耐受性，因此对其进行进一步的研究。

1.2.2 S2菌株的鉴定 菌株的形态观察及生理生化试验参照《常见细菌系统鉴定手册》方法[15]进行。

1.2.3 16S rDNA序列测定及系统发育树的构建 Cr6+耐受细菌送生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA扩增及序列测定。提交菌株的16S rDNA序列到美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站，与已知的序列比对分析其同源性。利用ClustalX1.81将序列进行比对，利用MEGA 5.05分子进化遗传分析软件分析碱基组成、GC含量，利用Kimura2参数计算遗传距离，采用NJ邻近法构建系统发育树。

1.2.4 S2菌株ACC脱氨酶活性和产IAA能力的测定 ACC脱氨酶分解ACC产生的α-酮丁酸用来测定ACC脱氨酶活性，参照Penrose等的方法测定α-酮丁酸含量[16]。根据Bradford方法测定菌体蛋白含量[17]。根据α-酮丁酸和蛋白质的标准曲线确定ACC脱氨酶活性。

将S2菌株挑1环到含有20 mL微量蔗糖盐液体（SMS）培养基[蔗糖1%、（NH4）2SO4 0.1%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.05%、NaCl 0.01%、酵母提取物0.05%、CaCO3 0.05%，pH值7.2]的錐形瓶中28 ℃、140 r/min培养96 h，液体培养基中加入 0.5 mg/mL 的色氨酸。取1.5 mL悬浮液到2 mL离心管中 5 000 g 离心15 min，取上清液1 mL到5 mL比色管中加入 2 mL Salkowskis溶液，振荡混匀室温静置20 min，比色管中溶液会出现粉红色，在530 nm检测粉红色物质的吸光度[18]。1个菌株做3个重复，根据IAA的标准曲线确定菌株产IAA能力大小。

1.2.5 溶磷和Cr6+耐受试验 将待测菌株S2接种于含无机磷酸盐的Pitkovskaya琼脂培养基，30 ℃倒置培养5 d。若细菌菌落周围出现清晰的晕圈，表明细菌溶解无机磷酸盐[19]。

将待测菌株划线接种至LB培养基中，培养基中加入 100～1 800 mg/L K2Cr2O7，50为1个梯度进行菌株耐受Cr6+试验，倒置培养箱中28 ℃培养5 d，观察菌株的生长情况以此来确定生长浓度和最低致死浓度。

1.2.6 S2菌株对不同Cr6+浓度下玉米幼苗生长的影响 采用改良的Belimov等的方法确定根际细菌的植物促生根长活性[20]。接种3株菌株S2、W3、S70至6 mL LB液体培养基中28 ℃、180 r/min培养24 h，用无菌水悬浮菌体数为5×107 CFU/mL。1 mL细菌悬浮液或无菌水（未处理的对照组）加入到含有40 mL Hoagland半固体培养基[KNO3 607.00 mg、Ca（NO3）2·4H2O 945.00 mg、MgSO4·7H2O 493.00 mg、NH4 H2PO4 115.00 mg、H3BO3 2.86 mg、MnCl2·4H2O 2.13 mg、ZnSO4·7H2O 0.22 mg、CuSO4·5H2O 0.08 mg、H2MoO4·H2O 0.02 mg、FeSO4· 7H2O 5.57 mg、Na2-EDTA 7.45 mg]试管中（内径30 mm）[21]。处理组在半固体培养基中加入适当的Cr6+，浓度依次为10、50、100 mg/L，对照组不加金属离子。用3% H2O2和95%乙醇（体积比1 ∶ 1）对白菜幼苗表面灭菌 20 min，无菌水冲洗数次至种子表面无气泡产生，挑选15个种子到Hoagland半固体培养基，所有的试验处理组作3次重复。在光照培养箱中28 ℃黑暗培养15 d，培养后测量玉米幼苗的根长、茎长、叶面积、鲜质量。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 13.0 one-way ANOVA进行分析;多重比较采用Fishers Student-Newman-Keulsa，b。

2 结果与分析

2.1 Cr6+耐受菌株S2的分离与鉴定

从污染土壤中分离得到Cr6+耐受菌株S2，G+、短杆状，在含有Cr6+营养琼脂平板上形成圆形湿润的橙黄色菌落。由表1可知，菌株S2触酶阳性，氧化酶阴性，能还原硝酸盐，水解明胶、淀粉和酪素，分解葡萄糖、蔗糖、半乳糖。根据菌体形态特征和生理生化，菌株S2为Exiguobacterium spp.。为了证实这一点，菌株的分子鉴定通过16S rDNA基因测序和基因Blast比对。由图1可知，菌株S2与Exiguobacterium sp. SH20（KU696286.1）具有密切的同源性。菌株S2的16S rDNA序列以唯一的登录号MH180821进入GenBank。为了确定菌株的系统发育位置，笔者使用NCBI获得的序列及MEGA 5.10软件构建了系统发育树（图1）。

2.2 S2菌株ACC脱氨酶活性和产IAA能力测定

植物不断地暴露在非生物胁迫中，例如干旱、重金属等。引入含有ACC脱氨酶的植物促生菌到重金属土壤中能够缓解这种胁迫对植物生长的影响，植物促生菌能够在这种胁迫下生存，并结合在种子的表面或者植物的根上，通过ACC脱氨酶降解乙烯的直接前体ACC来降低植物体内乙烯的含量，从而促进植物的生长和发育[22]。植物促生菌也通过合成IAA的方式促进植物的生长，IAA直接刺激植物细胞的延生和分裂或者提高植物自身的防御系统[23]。Exiguobacterium sp. S2具有较高的产IAA能力和ACC脱氨酶活性，不溶解磷酸盐（表2）。

2.3 Cr6+耐受菌株对不同Cr6+浓度下玉米幼苗生长的影响

玉米幼苗的根长和叶面积对Cr6+效应表明，玉米生长容易受这种金属的影响，这种效应随着重金属浓度的增加会更明显（表3）。接种3株Cr6+耐受菌株的玉米幼苗的根长、叶面积结果表明，相对于未接种Cr6+耐受菌株的对照组，接种Cr6+耐受菌株有利于植物根和叶面积的生长;不同浓度Cr6+接种S70菌株的玉米幼苗根长与对照组相比显著减少;处于不同浓度的Cr6+时接种S2菌株有利于玉米根和叶面积的生长（表3）;在不同浓度（10、50、100 mg/L）的Cr6+存在时，接种S2菌株的玉米幼苗的平均根长分别增加95.74%、41.34%、194.12%，平均茎长分别增加32.03%、-30.13%、28.96%，平均叶面积分别增加 73.94%、35.17%、26.92%，平均鲜质量分别增加33.33%、33.62%、-20.00%。在不同浓度的Cr6+存在时，菌株S2、S70、W3接种的玉米幼苗的平均根长、茎长、叶面积都有所增加或者减少，相比之下Cr6+对植物根长、叶面积影响比较大，对茎长、鲜质量的影响比较小，随着浓度的增加这种响应越明显，再次证明Cr6+对白菜生长的影响比较严重（表3）。

在该研究中S2菌株经过测定，既含有ACC脱氨酶又能产生吲哚乙酸，不溶解磷酸盐。根据形态特征、生理生化特征和16S rRNA初步鉴定为Exiguobacterium sp. S2。具有ACC脱氨酶活性的菌株通过减少乙烯含量帮助植物抵抗逆境胁迫，是因为ACC脱氨酶水解ACC为α-酮丁酸和氨[24]。试验中不同浓度的Cr6+（10、50、100 mg/L）对玉米幼苗的生长有毒害作用，但是当接种Cr6+耐受菌株Exiguobacterium sp. S2后，玉米幼苗的根长、叶面积明显大于对照组。当Cr6+浓度为100 mg/L时，接种S2、S70、W3菌株都有利于玉米幼苗根长和叶面积的生长，说明3株Cr6+耐受菌株之间有显著的差异性。

3 结论与讨论

在重金属环境中一些植物促生菌能够显著促进植物生长[11]。植物促生菌作为植物种子菌剂，应用到含有重金属的土壤中，已经证明能够根本性地减少重金属对植物的毒害，同时提高植物的总体增长和产量收益[25]。Bharti等研究了2种耐盐PGPR，Bacillus pumilus STR2和深海细菌（Exiguobacterium oxidotolerans） STR36，其中從盐碱土植物根际分离到的E. oxidotolerans STR 36菌株能够分泌丰富的胞外多糖，缓解高盐对植物体的胁迫，在原生盐碱土、次生盐碱土中接种Exiguobacterium oxidotolerans STR36的婆罗米植株生物量比未接菌分别高出109%、138%;植物体中活性物质三萜皂苷假马齿苋皂苷A（bacoside-A）含量比未接菌植株分别高出36%、76%[26]。本研究中接种菌株S2的玉米幼苗生物量与对照组相比分别增加33.33%、33.62%、-20.00%，也证实了这一点。Dastager等从印度喀拉拉邦省的西加特森林土壤中分离得到1株植物促生菌Exiguobacterium NⅡ-0906，NⅡ-0906菌株于30 ℃能溶磷 84.7 μg/（mL·d），合成嗜铁素，分泌氢氰酸（HCN），可对常见的植物致病真菌产生拮抗作用，接种了NⅡ-0906菌株的植物根、茎和生物量均有显著增加[27]。乙酰短杆菌（Exiguobacterium acetylicum） 1 P（MTCC 8707）是1株从苹果果园根际土壤分离得到的细菌，MTCC 8707于15 ℃能溶磷（21.1±1.18） μg/（mL·d），合成嗜铁素，分泌HCN，可对常见的植物致病真菌产生颉颃作用，MTCC8070具有分泌IAA的能力[28]。这2种E. spp.（Exiguobacterium NⅡ-0906、Exiguobacterium acetylicum 1P）不仅可以提高生物质产量，并且能够增强植物的抗逆性。

在重金属Cr6+胁迫下，接种Exiguobacterium sp. S2玉米幼苗的各种生理指标表明，在不同浓度Cr6+存在时都能促进植物总体的增长;这项工作证明了存在重金属Cr6+时引入微小杆菌能确保植物的生存，甚至保护它们;植物效应与重金属浓度、污染物的接触时间、植物固有的抗性有关。当存在微小杆菌时，能够维持玉米幼苗根长、叶面积、茎长的生长，对重金属的耐受性试验表明这种植物与微小杆菌之间有协同作用，特别是Exiguobacterium sp. S2对污染物影响的回应。微小杆菌就像分析的那样，可以推荐用来增加植物的生物量，稳定或修复重金属污染的土壤。Exiguobacterium spp.分布广泛，生存环境多样，具有分解复杂有机污染物、转化重金属、促生作用等极具实用价值的功能。

参考文献：

[1]Karthik C，Ramkumar V S，Pugazhendhi A，et al. Biosorption and biotransformation of Cr（Ⅵ） by novel Cellulosimicrobium funkei strain AR6[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2017，70：282-290.

[2]Cervantes C，Campos-García J，Devars S，et al. Interactions of chromium with microorganisms and plants[J]. FEMS Microbiology Reviews，2001，25（3）：335-347.

[3]Tang S R，Wilke B M，Brooks R R. Heavy-metal uptake by metal-tolerant Elsholtzia haichowensis and Commelina communis from China[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis，2001，32（5/6）：895-905.

[4]Khan A G. Relationships between chromium biomagnification ratio，accumulation factor，and mycorrhizae in plants growing on tannery effluent-polluted soil[J]. Environment International，2001，26（5/6）：417-423.

[5]Karagiannidis N，Hadjisavva-Zinoviadi S. The mycorrhizal fungus Glomus mosseae enhances growth，yield and chemical composition of a durum wheat variety in 10 different soils[J]. Nutrient Cycling in Agroecosystems，1998，52（1）：1-7.

[6]Davies J T，Puryear J D，Newton R J，et al. Mycorrhizal fungi enhance accumulation and tolerance of chromium in sunflower（Helianthus annuus）[J]. Journal of Plant Physiology，2001，158（6）：777-786.

[7]Davies J T，Puryear J D，Newton R J，et al. Mycorrhizal fungi increase chromium uptake by sunflower plants：influence on tissue mineral concentration，growth，and gas exchange[J]. Journal of Plant Nutrition，2002，25（11）：2389-2407.

[8]Burd G I，Dixon D G，Glick B R. A plant growth-promoting bacterium that decreases nickel toxicity in seedlings[J]. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（10）：3663-3668.

[9]Cobbett C S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification[J]. Plant Physiology，2000，123（3）：825-832.

[10]Jones D L，Hodge A，Kuzyakov Y. Plant and mycorrhizal regulation of rhizodeposition[J]. New Phytologist，2004，163（3）：459-480.

[11]Gupta D K，Rai U N，Sinha S，et al. Role of Rhizobium（CA-1）inoculation in increasing growth and metal accumulation in Cicer arietinum L. growing under fly-ash stress condition[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2004，73（2）：424-431.

[12]Rajkumar M，Ma Y，Freitas H. Characterization of metal-resistant plant-growth promoting Bacillus weihenstephanensis isolated from serpentine soil in Portugal[J]. Journal of Basic Microbiology，2008，48（6）：500-508.

[13]Kuffner M，Puschenreiter M，Wieshammer G A，et al. Rhizosphere bacteria affect growth and metal uptake of heavy metal accumulating willows[J]. Plant and Soil，2008，304（1/2）：35-44.

[14]Compant S，Clément C，Sessitsch A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants：their role，colonization，mechanisms involved and prospects for utilization[J]. Soil Biology and Biochemistry，2010，42（5）：669-678.

[15]東秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[16]Penrose D M，Glick B R. Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Physiologia Plantarum，2003，118（1）：10-15.

[17]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.

[18]Sheng X F，Xia J J，Jiang C Y，et al. Characterization of heavy metal-resistant endophytic bacteria from rape （Brassica napus） roots and their potential in promoting the growth and lead accumulation of rape[J]. Environmental Pollution，2008，156（3）：1164-1170.

[19]Sagervanshi A，Kumari P，Nagee A，et al. Isolation and characterization of phosphate solublizing bacteria from anand agriculture soil[J]. International Journal of Life Science and Pharma Research，2012，2（3）：L256-L266.

[20]Belimov A A，Hontzeas N，Safronova V I，et al. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard （Brassica juncea L. Czern）[J]. Soil Biology and Biochemistry，2005，37（2）：241-250.

[21]Zhang Y F，He L Y，Chen Z J，et al. Characterization of lead-resistant and ACC deaminase-producing endophytic bacteria and their potential in promoting lead accumulation of rape[J]. Journal of Hazardous Materials，2011，186（2/3）：1720-1725.

[22]Glick B R，Penrose D M，Li J P. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria[J]. Journal of Theoretical Biology，1998，190（1）：63-68.

[23]Patten C L，Glick B R. Role of pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（8）：3795-3801.

[24]Glick B R. Modulation of plant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase[J]. FEMS Microbiology Letters，2005，251（1）：1-7.

[25]Chaudri A M，Allain C，Barbosa-Jefferson V L，et al. A study of the impacts of Zn and Cu on two rhizobial species in soils of a long-term field experiment[J]. Plant and Soil，2000，221（2）：167-179.

[26]Bharti N，Yadav D，Barnawal D，et al. Exiguobacterium oxidotolerans，a halotolerant plant growth promoting rhizobacteria，improves yield and content of secondary metabolites in Bacopa monnieri （L.） Pennell under primary and secondary salt stress[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29（2）：379-387.

[27]Dastager S G，Kumaran D C，Pandey A. Characterization of plant growth-promoting rhizobacterium Exiguobacterium NⅡ-0906 for its growth promotion of cowpea （Vigna unguiculata）[J]. Biologia，2010，65（2）：197-203.

[28]Selvakumar G，Joshi P，Nazim S，et al. Exiguobacterium acetylicum strain 1P（MTCC 8707）a novel bacterial antagonist from the North Western Indian Himalayas[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2009，25（1）：131-137.