翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究

程顺 顾志敏 刘士力

摘要：采用试验生态——显微观察方法对翘嘴鲌精子的生理特性进行了研究，并用两步降温法超低温冷冻保存翘嘴鲌精子，筛选出适宜的稀释液与抗冻剂配方。结果表明，翘嘴鲌适宜的盐度范围为0～0.4%，pH值为5.5～8.0时，精子激活率较高，其中pH值为5.5时，精子运动时间与寿命最长;翘嘴鲌精子在4 ℃条件下保存84 h仍有48.33%的激活率，在25 ℃条件下保存84 h时精子死亡。以D-15为稀释液、10%乙二醇（EG）为抗冻剂，采用两步降温法超低温冷冻保存翘嘴鲌精子，解冻后精子活力最高。

关键词：翘嘴鲌;精子;生理特性;超低温冷冻;激活率

中图分类号： S961.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0175-04

翘嘴鲌属鲤科鲌亚科，为我国重要淡水名优经济鱼类。由于近亲繁殖、环境污染等原因，养殖翘嘴鲌的性状已出现不同程度的衰退。鉴于此，相关学者已对翘嘴鲌的耗氧率和窒息点[1]、生长特征[2-3]、个体生殖力[4]及营养需求[5-6]等进行研究，但关于翘嘴鲌精子生理特性及精子的超低温冷冻保存方面的研究尚未见报道。随着翘嘴鲌养殖产业的发展，精子生物学特性的研究显得尤为重要，将有助于加速其育种进程和产业化发展。与此同时，翘嘴鲌的遗传育种与优良种质资源的保存日益引起人们的重视，开展翘嘴鲌的精子冷冻保存研究，探索并改进保存方法，是其种质资源保护的有效途径之一，也能为翘嘴鲌遗传育种的研究提供优良种质材料。在鲌亚科鱼类中，此方面的研究未能引起足够重视，仅有对黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda）精子的相关研究，王贵英等以精子活力为指标，进行了黑尾近红鲌精子低温保存方法的研究，认为黑尾近红鲌精子最适的保存液配方为葡萄糖 2.90 g、KCl 0.05 g、CaCl2 0.02 g、NaHCO3 0.21 g、蒸馏水 100 mL、青霉素2.0×104 IU/mL，此配方可以使精子在4 ℃条件下保存156 h后活力仍达80%;并对黑尾近红鲌精子在不同盐度、不同水体及不同离体时间情况下的活力进行研究，筛选出黑尾近红鲌精子的最适盐度为0.5%，蒸馏水作为激活液好于自来水和池塘水，采用蒸馏水激活离体精子1～15 h发现，随着时间的延长，精子快速运动时间无显著差异，而精子成活率显著降低，但这些试验均未涉及超低温冷冻保存方面[7-8]。在鲤科鱼类中，此方面的研究工作较多，除了有精子的生理特性[9]、超微结构观察[10]等方面的研究，也有关于精子超低温冷冻保存方面的探索。陈松林等以D-15为稀释液、8%～12%的二甲基亚砜为抗冻剂，超低温冷冻保存草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鲤鱼（Cyprinus carpio）和团头鲂（Megalobrama amblycephala）的精子，获得的冷冻精子的活力分别为75%、75%、65%和65%[11]。丁淑燕等则选用Ringer液为稀释液、8%二甲基亚砜为抗冻剂，超低温冷冻兴国红鲤（Cyprinus carpio var. singuonesis）的精子，解冻激活后精子的活力达到了接近鲜精的水平[12]。

本研究以浙江省淡水水产研究所综合试验基地养殖的翘嘴鲌精子为试验材料，探讨不同盐度范围、不同pH值范围、不同保存温度及保存时间对翘嘴鲌精子活力的影响，旨在为其科学研究和生产实践提供基础数据。并以0.25 mL麦细管为冻存管、两步降温法研究了稀释液种类、抗冻剂种类与浓度对翘嘴鲌精子超低温冷冻保存效果的影响，旨在为翘嘴鲌精子超低温冻存技术的改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

翘嘴鲌取自浙江省淡水水产研究所綜合试验基地，于2017年6月在此基地进行试验，挑选健康状况良好、体表无伤、无病且性成熟的雄鱼作为试验材料。

1.2 激活液配制

（1）不同盐度溶液的配制。用纯水配制盐度分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%的NaCl溶液;（2）不同pH值溶液的配制。用NaOH或HCl调节纯水的pH值，分别配制pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的溶液。

1.3 稀释液配制

（1）CCSE2。用电子天平称取NaCl 0.342 7 g、蔗糖 3.431 4 g 溶于100 mL纯水。（2）D-15。用电子天平称取NaCl 0.80 g、KCl 0.05 g、葡萄糖1.50 g溶于100 mL纯水。（3）鱼用任氏液。用电子天平称取NaCl 0.780 g、CaCl2 0.021 g、KCl 0.02 g、NaHCO3 0.20 g溶于100 mL纯水。（4）Hanks液。用电子天平称取NaCl 0.801 g、KCl 0.04 g、CaCl2 0.014 g、NaHCO3 0.035 g、KH2PO4 0.006 g、葡萄糖0.034 g溶于100 mL纯水。（5）HBSS。用电子天平称取NaCl 0.789 6 g、KCl 0.039 6 g、MgSO4·7H2O 0.0 195 g、Na2HPO4·12H2O 0.007 2 g、KH2PO4 0.005 4 g、NaHCO3 0.034 5 g、葡萄糖 0.099 0 g 溶于100 mL纯水。以上5种稀释液保存于 4 ℃ 冰箱中待用。

1.4 抗冻液（稀释液+抗冻剂）配制

选取甲醇、乙二醇、二甲基亚砜和甘油4种抗冻剂，浓度梯度分别为5%、10%、15%，与5种稀释液混合共形成60组抗冻液配方。以上60种抗冻液保存于4 ℃冰箱中待用。

1.5 方法

1.5.1 精液采集 采精前10 h對雄鱼注射绒毛膜促性腺激素（HCG）和促黄体释放激素（LRH-A2），以促进其精子成熟。采集精子时用干毛巾擦干鱼腹部体表，轻压鱼腹使精液流出于离心管中，精子与抗冻液的比例为1 ∶ 5，4 ℃低温保存。

1.5.2 精子活力的检测 精液与激活液混合后在显微镜下观察精子活力（激活率、活动时间和寿命）。激活率是指精子与激活溶液混合后立即于显微镜下观察同一视野中运动精子的数量占全部精子数量的比例;运动时间是指精子自被激活开始至90%原地颤动为止的时间;寿命是指精子自被激活开始至90%停止运动所经历的时间。试验重复3次。

1.5.3 不同激活液对精子活力的影响 用移液枪吸取微量精液于事先滴加激活液的离心管中，迅速将其搅匀后滴加于载玻片上，在光镜下观测精子的激活率;离心管保存于4 ℃环境下，每隔一定时间滴加于载玻片上，在光镜下观测精子的运动时间及寿命。

1.5.4 不同抗冻液对精子冷冻保存的影响 将精液与抗冻液按1 ∶ 5比例混匀，于4 ℃下平衡5～10 min后分装入体积为0.25 mL的麦细管中（每支装约0.2 mL），将盛精麦细管平放于自制简易降温装置的液氮面上方3～4 cm处3～5 min后迅速转入液氮中保存。解冻时将麦细管从液氮中快速取出，立即置于40 ℃水浴中摇动溶化。用纯水激活后，在显微镜下检测冻精活力。试验重复3次。

1.6 数据处理

试验数据分析采用SPSS完成，统计结果以“平均值±标准差”（x±s）表示。

2 结果与分析

2.1 盐度对翘嘴鲌精子活力的影响

盐度为0～0.4%时，精子活力较高。精子激活率均在89%以上，其中在盐度为0.3%时达到最高值（91.33%）;精子激活后运动时间与寿命则区别明显，盐度为0.3%时明显比其他盐度的精子运动时间（198.00 s）与寿命（353.67 s）更长。盐度为0.5%时，精子活力开始受明显到抑制;盐度为0.7%时，精子呈不活动状态，并失去运动能力，但是用吸管继续向溶液中加1滴淡水后精子可被激活（图1、图2）。因此适宜翘嘴鲌精子的盐度范围为0～0.4%，其中最适盐度为0.3%。

2.2 pH值对翘嘴鲌精子活力的影响

pH值为4.5～10.0时，翘嘴鲌精子可被激活，但在pH值为4.5～5.5及9.0～10.0时，精子激活后的活力较低。pH值为5.5～8.0时，精子激活率较高，均超过88%，最高峰出现在pH值为7时，达到90.33%;pH值为5.5时，精子激活后的运动时间和寿命最长，明显超过其他pH组，达到 259.67 s 和400.33 s，之后随着pH值升高，精子激活后的运动时间和寿命逐渐下降（图3、图4）。

2.3 精子在不同保存时间与保存温度下的活力变化

翘嘴鲌精子活力随保存时间的延长而下降。在4 ℃条件下，精子在0～8 h中运动时间与寿命下降明显，从0 h的运动时间、寿命120.67、331.67 s急速下降至8 h的54.33、119.33 s，之后降速减缓，至84 h运动时间与寿命为8.33、14.67 s;激活率则始终缓慢下降，在44 h内激活率仍能保持70%以上，84 h的激活率为48.33%。在25 ℃条件下，精子在0～8 h 中运动时间与寿命下降明显，至8 h下降为49.33、89.33 s，之后降速减缓，至84 h精子死亡;激活率则始终逐步下降，在44 h内激活率仍能保持70%以上，至50 h活力下降相对明显，84 h死亡（图5、图6）。

2.4 翘嘴鲌精子超低温保存

将5种稀释液（CCSE2、D-15、鱼用任氏液、Hanks液及HBSS）与4种抗冻剂（甲醇、乙二醇、二甲基亚砜及甘油）的3种浓度（5%、10%、15%）两两混合，配制成60种不同的抗冻液，研究其对翘嘴鲌精子超低温冷冻的影响。结果表明，当抗冻剂为10%乙二醇时，冻精活力比其他抗冻剂组分高（图7、图8）;当稀释液为D-15时，冻精的活力比其他稀释液组分高。当抗冻剂为10%乙二醇时，以D-15为稀释液的冻精活力最高（图9、图10）;当稀释液为D-15时，以10%乙二醇为抗冻剂冻精活力最高（图7、图8）。因此，适宜翘嘴鲌精子冷冻保存的抗冻剂为10%乙二醇、稀释液为D-15，冻精激活率、运动时间和寿命分别为62.67%、63.33 min和 83.67 min。

3 讨论与结论

黄辨非等观察了兴国红鲤精子在盐度为0～5%的溶液中的运动情况，结果表明在盐度0.5%的溶液中，精子的快速运动时间和寿命最长;随后受到抑制，至盐度为1%时，精子完全不动[9]。王贵英等进行的黑尾近红鲌精子活力研究的结果也显示，在盐度0～0.5%范围内，精子活力随盐度的增加而延长，盐度0.5%时，活力最佳;而盐度>0.5%时，精子活力受到抑制;在盐度0.9%以上时则完全不动[8]。本研究中翘嘴鲌精子在不同盐度范围内的活力变化曲线与兴国红鲤、黑尾近红鲌基本一致，首先随着盐度的增加，活力逐渐加强，至最适盐度后，精子活力开始受到抑制。不同的地方是翘嘴鲌精子最适盐度为0.3%和盐度为0.5%时，活力开始受到抑制，盐度为0.7%时精子呈不活动状态。造成这些差异的原因，主要与不同鱼类精液的生理特性不同有关，虽然翘嘴鲌与黑尾近红鲌同为鲌亚科，与兴国红鲤同为鲤科，但翘嘴鲌体内精子的渗透压环境可能与其他鲤科鱼类略有不同，造成适盐范围不同。pH值是影响鲤科鱼类精子活力的重要参数[13]。翘嘴鲌精子在pH值为4.5～10.0范围内可被激活，激活率峰值出现在pH值为7.0时，运动时间和寿命峰值出现在pH值为5.5时。在鲤科鱼类中，精子激活率可能在一个较宽的pH值范围内影响不大，但运动能力最强的点一般出现于某个pH值[14]。在本研究中，pH值为5.5～8.0时，翘嘴鲌精子激活率均较高，此范围内激活率差异不大，而运动时间和寿命最长的pH值为5.5，明显高于其他pH值组。翘嘴鲌精子在pH值为5.5时表现出最长的运动时间和寿命，可能是由于当精子处于弱酸性环境中时，自身活动会被一定程度地抑制，从而减少运动消耗，有利于运动时间与寿命的延长，且pH值为5.5时对激活率的抑制效果不明显，精子仍能正常运动。温度对鱼类精子的活力具有重要影响，高温条件下精子运动能力较强，而低温条件下精子运动能力减弱、消耗的ATP减少。本研究结果表明，翘嘴鲌精子在 4 ℃ 下保存的效果明显比在25 ℃好，因此在低温条件下，精子的保存时间可以延长。另外，精子在保存前期，运动时间和寿命快速下降，而激活率则缓慢下降，说明精子离体后，与活力相关的指标中，激活率起初能保持一段时间的相对稳定，而运动时间和寿命会快速降低，提示在人工授精时，精子被挤出后要尽快受精或在特定稀释液中低温保存，以免精子的运动时间和寿命下降至精卵不能及时相遇。本试验显示，繁殖过程中挤出的精液在未进行人工授精时，可以通过盐度为0.7%或以上的溶液稀释置于4 ℃条件下低温保存;进行人工授精时，可采用盐度为0.5%或pH值为5.5的溶液稀释精液，在时间上为精卵相遇提供更多的机会，以利于受精率的提高。

鱼类精子超低溫冻存的抗冻液由稀释液及抗冻剂两部分组成。翘嘴鲌精子超低温冷冻的结果表明，当稀释液为 D-15、抗冻剂为10%乙二醇时，冻精活力最高。D-15作为稀释液最初即应用到了鲤科鱼类精子冷冻的研究中，陈松林等对我国主要淡水鲤科养殖鱼类草鱼、鲢鱼、鲤鱼和团头鲂等精子的超低温冷冻保存试验中研制出了理想的稀释液配方 D-15，并以8%～12%二甲基亚砜为抗冻剂，获得冷冻精子 65%～75% 的激活率[11]。此后，D-15作为稀释液普遍应用在了鲤科鱼类精子的超低温冷冻研究中[15-16]。不同鱼类精子超低温冷冻保存时所需的适宜抗冻剂的种类及浓度也有所差异。王晓爱等采用稀释液D-15，筛选出了适合软鳍新光唇鱼（Neolissochilus benasi）精子超低温冷冻保存的2种抗冻剂为10%甲醇和15%乙二醇[15]。王晓爱等以D-15溶液为稀释液，检测二甲基亚砜、甘油、乙二醇和甲醇对暗色唇鱼（Semilabeo obscurus）精子超低温冷冻保存效果的影响，认为二甲基亚砜和甘油并不适合作为暗色唇鱼精子冷冻的抗冻剂，甲醇和乙二醇具有相似的保护作用，适宜暗色唇鱼精子冷冻保存，并推测甲醇和乙二醇在暗色唇鱼精子冷冻复苏过程中对细胞膜起到了良好的保护作用[16]。在非鲤科鱼类精子冷冻中，也有EG作为抗冻剂效果较好的案例，孟令寀等以HBSS为稀释液，将二甲基亚砜、丙二醇、甘油、甲醇、乙二醇稀释成10%、20%、30%，对大泷六线鱼（Hexagrammos otakii）的精子进行超低温冷冻试验，结果表明，乙二醇各组的精子活力都较高，其中20%乙二醇组的抗冻保护效果最好[17]。但也有许多研究认为，二甲基亚砜与甲醇对鲤科鱼类精子抗冻保护效果较好[18]。Lahnsteiner等在对9种鲤科鱼类精子冷冻保存的研究中发现，二甲基亚砜表现出更好的抗冻保护效果。Chew等在对穗须原鲤（Probarbus jullieni）精子超低温冷冻的研究中发现，乙二醇不适宜穗须原鲤的精子保存，最适抗冻剂为甲醇[19]。Dietrich等以Volckaerts液为稀释液、10%二甲基亚砜或10%甲醇为抗冻剂，对湖鲫（Eupallasella percnurus）精子进行超低温冷冻试验，得到了50%的冻精复活率[20]。可见，由于种的特异性，精子超低温冻存中适宜的抗冻剂不同。不同抗冻剂对不同物种细胞的通透性存在差异，一般认为采用对精子细胞渗透性大的抗冻剂可以获得较高的精子冷冻复活率[21]。根据本研究的结果推测，造成10%乙二醇成为最优抗冻剂的原因可能是乙二醇分子量相对较小，其渗透能力比二甲基亚砜、甲醇及甘油更强，因此可以更快速高效地进入翘嘴鲌精子细胞内，与水结合以弱化结晶过程，减少冰晶的产生，提高精子的激活率;且乙二醇浓度为10%时，既能起到良好抗冻保护效果，又不会因其浓度过高对精子产生毒害。因此，翘嘴鲌精子冷冻保存宜选用10%乙二醇为抗冻剂。

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