基于SNP和SSR对甜玉米种质遗传多样性的评价

么大轩 张彬 刘松涛

摘要：利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）与简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）2种分子标记对23份甜玉米自交系进行遗传多样性评价。结果表明，6对针对su1基因的SNP引物分别在 7 790、8 210、10 550 bp位点处检测到22、17、23个自交系发生突变。23份甜玉米自交系在相似系数为0.55处被划分为4个SNP类群;用19对针对玉米10条染色体的SSR引物共检测出83个多态性位点，平均每对引物检测到的多态性位点数为4.4个，在相似系数为0.55处被划分为5个SSP类群。2种分子标记在类群划分中既存在一定的相关性，也存在一定的差异。用SNP、SSR法检测的平均遗传相似系数分别为0.64、0.71，表明23份甜玉米自交系存在比较丰富的遗传变异，种质资源较为丰富。

关键词：甜玉米;分子标记;SNP;SSR;聚类分析

中图分类号： S513.032  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0045-05

甜玉米是玉米属的一个亚种，起源于美洲大陆，是一种集粮、果、蔬、饲于一体的经济型作物，人类种植和食用甜玉米已有100多年的历史[1]。甜玉米鲜穗可直接上市或加工，乳熟时籽粒中富含蛋白质、水溶性多糖、多种游离氨基酸和维生素，具有较高的营养价值、加工价值和经济价值。随着人们生活水平的提高，甜玉米也迎来了更多的消费者[2]。美国是世界上开展甜玉米育种研究最早的国家，早在1828年，美国人索布就发表了关于甜玉米研究的第1篇论文，1836年诺埃斯·达林培育出了第1个甜玉米品种达林早熟[3]。而我国对甜玉米的研究起步较晚，直到1968年，才由中国农业大学培育出了首个甜玉米品种北京白砂糖[4]，到了20世纪80年代，又有一批新品种出现，如农梅Ⅰ号、东甜2号、金甜1号、甜玉2号等，但是其应用和推广面积有限[5-6]。

从20世纪90年代至今，随着我国经济的发展、人民生活水平的提高以及甜玉米加工产品的出现，对甜玉米的需求量与种质资源遗传多样性的需求不断提高[7]。但是，由于我国不是甜玉米的起源中心，很多材料依赖于从美国、泰国等海外引进，甜玉米的亲缘关系比较近，类型较单一[8]，从而严重影响了我国甜玉米育种的进一步发展。因此，对甜玉米的遗传多样性进行研究尤其重要。

近几年来，分子标记技术发展迅速，作为新的手段和方法已被用于检测玉米的遗传多样性，主要包括限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，簡称RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，简称AFLP）、简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）等分子标记技术。其中单个碱基变异的SNP作为第3代分子标记，具有密度高、分布广等优势，在水稻、玉米等植物性状标记分析、遗传图谱构建及遗传多样性分析等方面有广阔的应用前景[9-12]。在玉米上，康奈尔Buckle实验室和Illumina公司构建了高密度的SNP标记遗传连锁图谱，为分子育种提供了可靠的信息。SSR是一类由 1～6个碱基组成的基因串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于基因组的不同位置[13]。SSR具有多态性水平高、遗传方式简单、结果重现性好、稳定可靠、需要的DNA量少且操作简单等特点[14]，被育种研究者们广泛使用[15-16]。然而，目前利用分子标记对甜玉米进行遗传多样性研究的报道还较少。

为了综合SNP分子标记与SSR分子标记的优点，增强试验的准确性及稳定性，同时探究2种分子标记的联系与差异，本研究采用SNP、SSR 2种分子标记同时对23份甜玉米材料进行遗传多样性研究，以期为甜玉米育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用的23份甜玉米自交系（均为su1甜玉米）和1份常规对照自交系由河北农业大学玉米研究室提供，其名称详见表1。

SNP检测试验所用引物参照韩国Shin等研究设计的6对SNP引物[17]，详见表2。SSR检测试验所用引物参照CIMMYT（国际玉米小麦改良中心）公布的针对玉米10条染色体的核心引物，从中筛选出19对带型清晰、稳定性好的引物进行SSR分析，相应的引物序列见表3。以上引物均由北京天一辉远生物科技有限责任公司合成。

1.2 试验方法

本试验于2015年在河北农业大学种子科学与技术实验室进行，甜玉米材料种植于河北农业大学三分厂试验田。取0.5 g甜玉米鲜叶片，用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，简称CTAB）法对供试的23份甜玉米进行DNA提取，并用NanoDrop ND1000型紫外分光光度计测定DNA分子D260 nm/D280 nm及浓度，之后统一将浓度稀释至100 ng/μL，于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 PCR反应体系和条件

20 μL PCR反应体系：2 μL 10×Taq 缓冲液（含Mg2+）、1.6 μL dNTP（2.5 mmol/L）、1 μL前引物、1 μL后引物、0.2 μL Taq酶（2.5 U/L）、1 μL DNA模板（100 ng/μL）、13.2 μL ddH2O。反应程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 变性 30 s，X ℃退火[X=（前引物Tm+后引物Tm）/2-1，Tm为理论退火温度]45 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.4 PCR产物的检测

1.4.1 琼脂糖凝胶电泳 在每个PCR体系中加入5 μL加样缓冲液6×loading buffer，取10 μL上样于1.5%琼脂糖凝胶上，于180 V、300 mA、80 W电泳15 min，用EB（溴化乙锭）显色，用BioRAD凝胶成像系统观察拍照，记录条带信息。

1.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在每个PCR体系中加入5 μL加样缓冲液6×loading buffer，取2 μL上样于6%聚丙烯酰胺凝胶上，于300 V、200 mA、100 W电泳45 min，用银染法显影，将胶置于灯箱上观察拍照，记录条带信息。

1.5 数据处理及分析方法

根据PCR产物电泳结果读取条带，同一长度处有带的记为1，无带的记为0，缺失的记为9，用NTSYS Version 2.10e软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果分析

用6对针对su1基因设计的SNP引物进行PCR扩增，其中在1～23号供试甜玉米中均能检测到点突变，而对照常规玉米自交系Mo17在所检测的3个变异位点上均无扩增条带，即在检测的3个位点上均无变异，8210（A/G）位点的检测结果见图1。

由表4可以看出，在7790位点处，有22个自交系发生突变，116327、116329、116353等15个自交系发生C碱基突变，116359-60、 116377、116432等7个自交系发生T碱基突变。

在829位点处，有17个自交系发生突变，116327、116377-78、116390等8个自交系发生A碱基突变，116432、116471、116484等9个自交系发生G碱基突变。在10550位点处，23个自交系全部发生突变，116432、116455、116471等5个自交系发生G碱基突变，116469、116379、116385等18个自交系发生A碱基突变。

通过对10条染色体的核心引物进行筛选，获得19个条带清晰、多态性强的SSR引物。利用筛选出的引物对供试的23份甜玉米材料进行DNA扩增，其中引物bnlg439的扩增条带如图2所示。对全部扩增结果进行统计分析，结果显示，扩增出的条带数在4～11条之间，19对SSR引物共扩增出114条条带，其中多态性条带83条，平均每对引物检测到的多态性位点为4.4个，多态性条带数占总条带数的73%。

2.2 遗传相似性分析

根据2种分子标记结果，计算23份甜玉米的遗传相似系数，其中SNP相似系数为0.28～1.00，平均遗传相似系数为0.64;SSR遗传相似系数为0.47～0.95，平均遗传相似系数为0.71。由此可见，2种标记方法的平均遗传相似系数基本一致，说明含有su1基因的甜玉米突变体的遗传背景存在比較丰富的遗传变异。

2.3 聚类分析

当相似系数为0.55时，23份甜玉米材料被划分为4个SNP类群（SNP groups，简称SNPGs），分别为SNPGⅠ、SNPGⅡ、SNPGⅢ和SNPGⅣ（图3）。由表4可以看出，SNPG Ⅰ包含116327、116390、紫su5-3、紫su5-12、紫su5-3-3、116377-78、116385、黄su7-8、116375、116329、116353、116379、116394、116424共14份材料，占60.9%;SNPG Ⅱ仅含有1份材料，即116455，占4.3%;SNPG Ⅲ、SNPG Ⅳ各含有4份材料，分别为116359-60、116377、红su5、116469和116432、116471、116485、116484，各占供试材料的17.4%。

由图4的SSR标记聚类结果发现，当相似系数为0.55时，23份甜玉米自交系被分为5个类群（SSR groups，简称SSRGs）。其中SSRGⅠ包括紫su5-3、紫su5-12、黄su7-8、116390、116329、116375、紫su5-3-3等13份材料;SSRGⅡ和SSRGⅣ分别包含116359-60、116394、116424和 116377-78、116469、116471;SSRGⅢ和SSRGⅤ分别包含116484、116485和116432、116455（表5）。

3 讨论

玉米胚乳基因组内某一特定核苷酸位置发生转换、颠倒、插入、缺失等都有可能使其突变为甜玉米。su突变体编码的蛋白质，即异淀粉酶是淀粉去分支酶的一种[18-19]，能使糖向淀粉的转化过程受阻，造成中间产物大量积累，因而发生相应突变的玉米中的蔗糖、还原糖含量显著高于普通玉米，使玉米未成熟籽粒中大量积累水溶性多糖[20-21]。

本试验应用SNP、SSR 2种分子标记研究su1型甜玉米。su1基因位于第4染色体的第8～66位点，在该位点先后发现了sul-am、sul-B n2、sul-cr、sul-st和sul-R等等位基因[1]。本试验选用等位基因特异性PCR对su1基因的7790、8210及10550这3个SNP位点进行分型，该方法具有成本低、易操作等优点，但仍需要对引物退火温度以及反应条件进行一定的摸索。有报道指出，等位基因特异PCR反应体系具有很高的灵敏性[22]，然而试验中依然会有隐约的非特异性条带出现，本试验中检测的甜玉米在7790、8210、10550这3个突变位点中至少存在1～2个突变，PCR反应对退火和延伸过程的时间和温度比较敏感[17]，因而不适宜的反应条件可能会导致碱基错配，使得碱基发生非特异性结合。本试验通过适当提高退火温度，较大程度地抑制了非特异性条带的产生，与乐素菊等的研究结果[23]一致。SSR分子标记技术具有操作简单、重复性好等优点，是近10年来常用的研究遗传多样性的方法[24]。赵波等利用SSR标记，对小豆种质资源进行了遗传多样性分析，检测到86个等位变异[25]。陈婧等曾利用SSR分子标记技术对玉米进行了遗传多样性分析[26-28]。胡萍等利用SSR分子标记技术对贵州的108份玉米品种进行了遗传多样性分析，得出其遗传相似系数在0.44～0.99之间[29]。王利峰等利用表型和SSR分析了河南省玉米的遗传多样性，得出其遗传相似系数为0.63～0.89[30]。而本试验利用19对SSR引物对23份甜玉米自交系进行遗传多样性分析，共检测出80个等位基因有变异位点，检测到的等位基因数为4.4个，遗传相似度系数为0.47～0.95，表明甜玉米种质来源较广泛，遗传基础丰富。本研究将供试材料划分为5大类，从分子水平分析了甜玉米的群体遗传结构和多态性水平，为研究亲本选配、新种质创制等提供了依据。

本试验利用SNP、SSR 2种分子标记，研究了甜玉米的遗传多样性，在甜玉米亲缘划分上，2种分子标记存在一定的相关性，均能将紫su5-3、紫su5-12和紫su5-3-3等姊妹系聚在一起，同时也存在一定的差异，如SSR标记比SNP标记划分的类群多1个。本研究结果也验证了用分子标记探究种质资源血缘关系的科学性、准确性，由于引物数量及试验材料数量的限制，要得到更精确的群体结构划分还需要进一步研究。

参考文献：

[1]姚文华，韩学莉，汪燕芬，等. 我国甜玉米育种研究现状与发展对策[J]. 中国农业科技导报，2011，13（2）：1-8.

[2]赵久然，滕海涛，张丽萍，等. 国内外甜玉米产业现状及发展前景[J]. 玉米科学，2003（专刊）：98-100.

[3]曾孟潜，刘雅楠，杨涛兰，等. 甜玉米、笋玉米的起源与遗传[J]. 遗传，1999，21（3）：44-45.

[4]李小琴，吴景强，叶翠玉，等. 我国甜玉米育种概况及面临的挑战[J]. 作物杂志，2002（5）：45-46.

[5]吴燕丽. 广东省鲜食玉米产业发展现状与对策研究[D]. 武汉：华中农业大学，2008.

[6]石德权，郭庆法，汪黎明，等. 我国玉米品质现状、问题及发展优质食用玉米对策[J]. 玉米科学，2001（2）：3-7.

[7]番兴明，张世煌，谭 静，等. 根据SSR标记划分优质蛋白玉米自交系的杂种优势群[J]. 作物学报，2003，29（1）：105-110.

[8]戴惠学，陆作楣. 甜玉米二环系选育的早代判别法研究[J]. 种子，2006，25（5）：30-34.

[9]Rafalski A. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics[J]. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（2）：94-100.

[10]Jones E S，Sullivan H，Bhattramakki D，et al. A comparison of simple sequence repeat and single nucleotide polymorphism marker technologies for the genotypic analysis of maize（Zea mays L.）[J]. Theor Appl Genet，2007，115（3）：361-371.

[11]Varshney R K，Thiel T，Sretenovic-Rajicic T，et al. Identification andvalidation of a core set of informative genic SSR and SNP markers forassaying functional diversity in barley[J]. Mol Breeding，2008，22（1）：1-13.

[12]Pindo M，Vezzulli S，Coppola G，et al. SNP high-throughput screening in grapevine using the SNPlexTM genotyping system[J]. BMC Plant Biology，2008，8：12-17.

[13]曹永國. SSR标记在玉米杂种优势及遗传图谱中的应用研究[D]. 北京：中国农业科学院，2000.

[14]Barcaccia G，Lucchin M，Parrini P. Characterization of a flint maize （Zea mays var. indurate） Italian landrace：Ⅱ. Genetic diversity and relatedness assessed by SSR and Inter-SSR molecular markers. Genetic Resource and Crop Evolution，2003，50：253-271.

[15]Yao Q L，Yang K C，Pan G T，Rong T Z. Genetic diversity of maize （Zea may L.） landraces from southwest China base on SSR data[J]. Journal of Genetics and Genomics，2007，34（9）：851-860.

[16]Liu Z Z，Guo R H，Zhao J R，et al. Population structure and genetic diversity of maize landraces from the southwest maize region of China[J]. Maydica，2009，54（1）：63-76.

[17]Shin J H，Kwon S J，Lee J K，et al. Genetic diversity of maize kernel starch-synthesis genes with SNAPs[J]. Genome，2006，49（10）：1287-1296.

[18]王虎义. 玉米胚乳突变体Su5遗传分析和基因定位[D]. 长春：吉林大学，2012.

[19]杨泉女，王蕴波. 甜玉米胚乳突变基因的研究进展及其在育种中应用的策略[J]. 分子植物育种，2005，3（6）：125-130.

[20]李学渊，刘纪麟. 玉米胚乳突变基因与互作对籽粒成份的影响Ⅲ. su1基因与sh2、bt2基因的互作效应及其利用价值[J]. 作物学报，1993，19（6）：509-514.

[21]East E M，Hayes H K. Inheritance in maize[J]. Conn Agric Exp Stn Bull，1911，167：1-142.

[22]Bottema C D K，Sarkar G，Cassay J D，et al. PCR-amplification of specific alleles：a general method of rapidly detecting mutations，polymorphisms and haplotypes[J]. Meth Enzymol，1993，288（1）：388-402.

[23]乐素菊，刘鹏飞，曾慕衡，等. 超甜玉米bt2基因SNP位点的分析及分子标记辅助筛选[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（11）：73-78.

[24]江云珠. 中国稻种资源同工酶和SSR标记遗传多样性研究[D]. 北京：中國农业科学院，2002.

[25]赵 波，叶 剑，金文林，等. 不同类型小豆种质SSR标记遗传多样性及性状关联分析[J]. 中国农业科学，2011，44（4）：673-682.

[26]陈 婧，李建平. 西北地区糯玉米自交系遗传多样性研究[J]. 玉米科学，2014，22（3）：29-35.

[27]王凤格，田红丽，赵久然，等. 中国328个玉米品种（组合）SSR标记遗传多样性分析[J]. 中国农业科学，2014，47（5）：856-864.

[28]李齐向，张小中，涂前程，等. 基于SSR分子标记的青贮玉米自交系遗传多样性分析[J]. 福建农业学报，2013，28（4）：320-323.

[29]胡 萍，杨恩琼，施文娟，等. 贵州108份地方玉米品种的SSR遗传多样性分析[J]. 种子，2012，9（9）：61-65，68.

[30]王利锋，李会勇，唐保军，等. 利用表型和SSR标记分析河南省玉米地方品种的遗传多样性[J]. 中国农业科学，2009，42（4）：1136-1144.温书香，安利民，赵 协，等. 猪伪狂犬病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 江苏农业科学，2019，47（7）：50-53.