基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发

刘冬梅 娄喜艳 吴狄

摘要：通过对棉花转录组进行测序获得的57 695条Unigenes，利用MISA软件进行搜索，得出简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）的分布情况，共挖掘检索得到1 886个SSR位点，SSR的出现频率为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上，发生频率为3.05%，平均每20.8 kb会出现1个SSR位点。有117条Unigenes含有1个以上SSR位点，含有复合型SSR的Unigenes数目为56条，其中三核苷酸基元类型分布最多，SSR数量为 1 582个，占挖掘出总SSR数量的83.88%，而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小。最后通过Primer 3程序进行SSR引物设计，得到部分引物序列，可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。

关键词：棉花;转录组测序;SSR;分子标记;引物设计

中图分类号： S562.024  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0032-03

微卫星DNA，即简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR），通常构成其重复基元的核苷酸个数为1～6个，特点是长度长达几十个核苷酸，为串联重复序列。单一序列的保守性较强，在基因组中，微卫星侧翼序列就有此特性。因此首先通过克隆相应的微卫星侧翼DNA片段，对其数目进行扩增，然后对扩增DNA进行全部测序，再对微卫星的侧翼序列引物进行人工合成，最终实现通过PCR扩增微卫星的目的。自分子领域发展以来，人们最常用的分子标记技术主要有随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、序列标签位点（STS）、限制性片段长度多态性（RFLP）、单核苷酸多态性（SNP）、SSR等[1-6]。与其他分子标记相比，SSR标记具有其独特的优点，（1）SSR标记的操作非常简便，无需消耗大量试验器材即可进行，整个过程消耗的时间较其他几种分子标记短，且对于多态性而言，SSR标记所发掘出的多态性较高;（2）SSR标记所开发的位点具有多等位基因的特性，且在分子水平上，其提供的信息量较高;（3）SSR标记识别出的基因位点呈共显性，在整个基因组有着均匀分布，且整个过程无放射、辐射危险。SSR标记适用于DNA指纹图谱的构建[7]、基因定位[8]和遗传多样性分析[9]等方面。高度变异是微卫星中重复基元的显著特性，微卫星数目可呈现出整倍性变异，并且重复基元序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。

目前关于棉花全基因组SSR分子标记开发的研究报道较少，随着棉花品种数量的逐渐增多，田间表型农艺性状鉴定方法已难以满足快速并准确鉴定品种、质量、亲缘关系等的需求。本研究以陆地棉洞A转录组的测序结果为试验材料，对全转录组SSR位点进行挖掘，利用生物信息学技能和MISA软件，发掘基于陆地棉洞A基因型的SSR分子标记数据，在RNA水平上分析棉花SSR的特点及规律，以期为在分子水平上研究棉花种质资源、鉴定亲缘关系及进行分子辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 棉花转录组数据来源

2014年8月，以陆地棉洞A不育和可育花药为材料，委托深圳华大基因科技有限公司进行转录组测序，获得的全基因序列共包含57 695条Unigenes，以此为材料进行SSR位点的挖掘。

1.2 棉花转录组SSR位点检索

利用SSR位点挖掘软件MISA对陆地棉洞A花药的 57 695 条Unigenes进行SSR位点挖掘，共挖掘出6种不同类别的SSR，分别是单、二、三、四、五、六核苷酸SSR。

1.3 SSR引物挖掘

利用MISA软件进行SSR位点挖掘之前首先将单、二、三、四、五、六核苷酸重复次数的操作参数分别设置为 ≥12 bp、≥6 bp、≥5 bp、≥5 bp、≥4 bp、≥4 bp;其次对长度条件参数进行设置，当2个微卫星可以组合为1个复合微卫星时，这2个微卫星之间的距离必须小于100 bp。

1.4 引物设计

通过Primer 3程序进行SSR引物设计。

2 结果与分析

2.1 棉花转录组序列中SSR位点的数量

通过MISA软件对棉花转录组获得的Unigenes进行挖掘，从表1可以看出，共挖掘出1 886个SSR位点，SSR出现频率（搜索出的SSR数量与搜索序列总数的比值）为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上，发生频率（搜索出的含有SSR序列的数量与搜索序列总数的比值）为3.05%，平均每20.8 kb会出现1个SSR位点（搜索出的序列总长度与SSR总数量的比值）。其中含有1个以上SSR位点的Unigenes数量较少，有117条;含复合型SSR的序列数更少，为56条。

2.2 棉花转录组SSR基元频率特征及引物设计

由表2可知，棉花转录组的SSR种类较为丰富，本研究共挖掘到86种重复的SSR类型，且各重复类型之间的数量差别较大，分布极其不平衡。棉花转录组中三核苷酸SSR重复基元类型的分布最多，SSR重复基元数量为1 582个，占挖掘出总SSR数量的83.88%;SSR位点数范围为1～393个，最多的为AAG/CTT，其次是ATC/ATG，数量为 325个，AGC/CTG的数量为216个，ACC/GGT数量为209个。单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小，SSR重复基元数量分别为66、92、15、11、120个，总比例之和为16.12%。在棉花转录组Unigenes中，重復基元类型最多的是六核苷酸，为61种;其次是三核苷酸重复类型，有10种。从图1可以看出，在三核苷酸重复基元类型中，AAG/CTT的SSR位点数量最多，为393个，占总SSR位点数量的20.84%，发生频率为0.68%;其次是ATC/ATG，占总SSR位点数量的 17.23%;再次是AGC/CTG，占11.45%;ACC/GGT较少，占1108%;其他三核苷酸重复基元类型占总SSR位点的2328%。单、二、四、五、六核苷酸重复类型数量分别为2、4、3、6种，共占重复类型总数的17.44%。通过对棉花转录组57 695条序列进行SSR位点搜索，共搜索得到 1 886 个SSR位点，利用Primer 3引物设计程序所得出的部分SSR位点特异引物见表3。

2.3 棉花转录组序列中SSR基元重复次数分布

SSR位点的多态性是由基元重复次数的变化所决定的，通过棉花SSR位点重复次数分布统计结果（图2）可以得出，棉花转录组基元随着重复次数的增加，其数量和比例逐渐减少。棉花转录组SSR中基元重复次数主要集中在4～7次，占总数的94.91%，其中重复8～10次的SSR位点数量为28个，占总数的1.48%;重复11～14次数的SSR位点为61个（3.23%），重复15～17次的SSR位点有7个（0.37%），其中重复16次的SSR位点有0个。重复次数多于20次为较高重复次数，棉花转录组中没有重复次数高于17次的SSR位点，即无高重复次数的SSR位点，低重复次数（重复1～10次）与一般重复次数（重复11～20次）的SSR位点较多。

3 讨论

本研究利用棉花花药的转录组序列数据，从57 695条序列中成功挖掘检索出1 886个SSR位点， 棉花转录组序列中SSR位点的总发生频率为3.05%，通过对比杜仲（2.90%）[10]、南方红豆杉（2.07%）[11]可以发现，棉花转录组序列中SSR位点的发生频率略高，但略低于红松（4.24%）[12]，且明显低于樱桃（15.62%）[13]。棉花转录组SSR标记重复次数最多的是三核苷酸重复基元类型，高级基元重复次数较为微小，且跨度大，可为基元的重复次数与SSR标记的多态性呈正相关提供依据[14]。三核苷酸中的AAG/CTT基元的丰度最高，这与海甘蓝三核苷酸为丰度最高的基元[15]一致，即棉花转录组SSR中三核苷酸SSR在理论上具备更高的多态性，可作为潜在的SSR重复基序进行有关的引物挖掘及开发。由此推测，通过利用棉花转录组得到的SSR引物，同样可以用来进行棉花的遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。

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