高寒阴湿区6个抗寒紫花苜蓿种质氨基酸积累量分析

魏双霞，师尚礼，康文娟，谭谌淼

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

苜蓿为多年生植物，利用年限达5～6年，甚至更长[1]，并且是一种高蛋白植物[1]，富含VA、VE和Fe、Ca等营养物质，苜蓿所含蛋白质大部分存在于叶片中，含量30%～40%，蛋白质的消化率达70%以上，在单位面积上紫花苜蓿比谷类和油料作物能产出更多的蛋白质，是发展优质高效畜牧业的物质基础，也是人类有益健康的食用植物之一，而且紫花苜蓿所含氨基酸种类全面，研究表明，紫花苜蓿含有18种以上氨基酸，包括人和动物全部必需的氨基酸和一些稀有氨基酸[3-4]。随着我国畜牧业尤其是奶业的迅速发展，对苜蓿的需求量日益增加，但其总量供应不足，优质苜蓿尤为缺乏[5]。张鹏[6]、韩学俊[7]、肖海峻[8]等对苜蓿种质材料的氨基酸进行分析，筛选出了氨基酸含量较高的苜蓿品种。因此，从不同角度对我国苜蓿种质资源进行深入评价研究，将有助于我国苜蓿种质资源的进一步开发利用。青藏高原素有“世界屋脊”和“世界第三极”之称[9]，是我国重要的草地畜牧业基地之一，但过度放牧使天然草地产量下降，毒杂草滋生，牧草品质降低[10]。通过对6份参试苜蓿种质材料在青藏高原高寒阴湿区引进种植，进行叶部、茎部氨基酸种类和含量、氨基酸组成、氨基酸评分(AAS)和必需氨基酸指数分析，评定蛋白品质和营养价值，旨在从6个抗寒苜蓿种质材料选育出适宜青藏高原种植的蛋白质品质较高的抗寒苜蓿新材料，为解决青藏高原地区牧草营养不平衡问题提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2013年4月～2015年5月在高寒阴湿区的甘南州夏河县牧草试验站进行。夏河县位于甘南藏族自治州西北部，E 101°54′～103°25′，N 34°32′～35°34′，地处青藏高原东北边缘，地势由西北向东南倾斜，海拔3 000～3 800 m，属于寒冷湿润性气候，土壤类型为高寒草甸土，有明显的腐殖质积聚，腐殖质层厚10 cm，呈灰棕至黑褐色粒状-扁核状结构，土壤有机质含量45.14 g/kg，pH 7.87，速效氮50.83 mg/kg，速效磷10.57 mg/kg，速效钾230.0 mg/kg，土壤肥力均匀。

1.2 试验材料

供试材料GNKH-1 (Cold resistance No.1 of alfalfa)、GNKH-2 (Cold resistance No.2 of alfalfa)和GNKH-3(Cold resistance No.3 of alfalfa 3)为甘肃农业大学草业学院选育的抗寒苜蓿品系，具有较强的抗寒能力和优质高产性能。对照材料为抗寒能力强的俄罗斯西伯利亚杂花苜蓿(M.sativasubsp.varia)(FD 2)、金皇后紫花苜蓿(M.sativacv.Golden Empress)(FD 2)和阿尔冈金紫花苜蓿(M.sativacv.Algonguin)(FD 3)，均由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供。

1.3 试验设计

试验采用随机区组设计，小区面积3 m×5 m，3次重复，采用深开沟，浅覆土，冬前耙平的播种技术：人工开沟条播，沟深12～15 cm，覆土1～2 cm，冬前耙平埋颈，行距30 cm，播量1.7 g/m2。适时对试验地进行锄草及病虫害防治等田间管理。播种第2年，3个抗寒苜蓿品系返青、分枝、现蕾、开花、结荚、枯黄各物候期时间较为一致，对照品种俄罗斯西伯利亚杂花，金皇后和阿尔冈金各物候期时间较为一致，但GNKH-3和GNKH-2较其他几个品种提前10 d进入返青，提前5 d进入现蕾期，各品种均能结荚，种子均未成熟，第2年刈割测定两茬，第1年刈割测产1次，测产时，对每个小区生长状况良好的苜蓿的茎、叶各采样1 kg，风干混合，3次重复。

1.4 样品前处理

样品在85℃下干燥4 h，磨细混匀，取样10 mg，精密称定。置安瓿瓶中，用6 molHCl封管水解[(110±1)℃]24 h，真空抽去过量氯化氢气体，微量过滤器过滤，滤渣用蒸馏水淋洗3遍，合并滤液，在水浴上蒸干，蒸干后的残渣加入蒸馏水溶解，并定容至10 mL。每次吸取50 μL注入氨基酸自动分析仪中进行氨基酸测定。测胱氨酸时，需将水解液用过甲酸氧化3 h，再上机分析。

1.5 仪器条件

氨基酸自动分析仪为日立835-50型。除氨柱：L4×50 mm；分析柱：2.6 mm×150.0 mm不锈钢柱；树脂：2619号；柱温：52℃；反应温度98℃；pH 5～5.5；缓冲液流量：0.230 mL/min；柱压：8～9 MPa；茚三酮流速：0.28 mL/min。

1.6 蛋白质氨基酸分析方法

氨基酸含量 100 g草样中含有的氨基酸的g数。氨基酸评分 将高寒阴湿区苜蓿叶、茎中必需氨基酸含量分别与1985年的WHO的必需氨基酸需要量模式[11-17]进行比较，进行氨基酸评分(AAS)，计算公式为：

(1)

必需氨基酸指数 将叶和茎中蛋白质的必需氨基酸含量与模式蛋白氨基酸[18]进行比较，计算必需氨基酸指数(EAAI)，计算公式为：

(2)

式中：aai为受试蛋白质中某一个必需氨基酸所占必需氨基酸总数的百分比。AAi是模式蛋白质中此氨基酸占必需氨基酸总数的百分比。必需氨基酸指数评价蛋白源的营养价值。当n=6～12，提出的实用评价标准是EAAI>0.95为优质蛋白源，0.85

2 结果与分析

2.1 叶、茎氨基酸种类和含量特征

供试苜蓿材料中均检测出了18种氨基酸，包括9种必需氨基酸。供试苜蓿材料各组分氨基酸按含量多少排序有一定的规律性，含量最高的氨基酸都是天门冬氨酸，含量最低的氨基酸都是胱氨酸和色氨酸，这与王照兰[19]2004年对苜蓿材料的氨基酸分析得出的结果相一致。高寒阴湿区叶部和茎部的脯氨酸含量均比较高，这与陶雅[20]等研究结果一致，苜蓿在寒冷环境下会积累Pro等氨基酸以提高苜蓿的抗寒性；而Trp、Arg、Glu和Gly茎含量高寒阴湿区较低，这可能与苜蓿样品的采集时间不同和气候区环境不同所造成。

供试苜蓿材料叶部T平均为22.52%，E平均为7.65%，E/T平均为33.95%，E/N平均为51.41%。GNKH-2叶部T最高(23.86%)，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-3次之(23.57%)，也显著高于其他4个品种，供试苜蓿材料叶部T排序为：GNKH-2>GNKH-3>俄罗斯西伯利亚杂花>金皇后>GNKH-1>阿尔冈金。金皇后叶部E最高(8.55%)，GNKH-2、GNKH-3次之，它们显著高于其他3个品种，GNKH-2是抗寒苜蓿新品系中叶部E最高的(8.55%)，较最高的金皇后(8.55%)仅低0.09%，供试苜蓿材料叶部E排序为：金皇后>GNKH-2>GNKH-3>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-1>阿尔冈金(图1)。叶部E/T均低于鸡蛋蛋白(49.7%)模式，但都高于FAO/WHO模式标准蛋白(35.0%)，金皇后叶E/T和E/N最高(39.40%和65.00%)，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-1是抗寒苜蓿新品系中叶部E/T和E/N最高的(36.97%、58.66%)，较含量最高的金皇后(39.40%和65.00%)低6.15%、9.75%，抗寒苜蓿新品系显著高于俄罗斯西伯利亚杂花和阿尔冈金，由苜蓿材料叶部的E/T和E/N可知，供试苜蓿材料叶部蛋白品质排序为：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花(图2)。

图1 苜蓿材料叶部T和E(%)Fig.1 The T and E in leaf type of alfalfa materials(%)注：Ⅰ- GNKH-1，Ⅱ- GNKH-2，Ⅲ- GNKH-3，Ⅳ-俄罗斯西伯利亚杂花苜蓿，Ⅴ-金皇后苜蓿，Ⅵ-阿尔冈金苜蓿；E-必需氨基酸总量，N-非必需氨基酸总量，T-氨基酸总量；下同

图2 苜蓿材料叶部E/T和E/N(%)Fig.2 The E/T and E/N in leaf type of alfalfa materials (%)

综合分析供试苜蓿材料在高寒阴湿区的叶部蛋白品质表现，GNKH-1、GNKH-3和GNKH-2叶部蛋白品质虽然不及金皇后紫花苜蓿，但均显著高于俄罗斯西伯利亚杂花、阿尔冈金。GNKH-1为适宜高寒阴湿区的叶部蛋白品质最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2仅次GNKH-1。

供试苜蓿材料茎部T平均为10.42%，E平均为3.27%，E/T平均为31.31%，E/N平均为45.62%。俄罗斯西伯利亚杂花茎部T最高(12.11%)，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中茎部T最高的(10.57%)，但较最高的俄罗斯西伯利亚杂花(12.11%)低12.72%，供试苜蓿材料茎部T排序为：俄罗斯西伯利亚杂花>金皇后>GNKH-3>阿尔冈金>GNKH-2>GNKH-1。金皇后茎部E最高(4.30%)，显著高于其他品种，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系茎部E最高的(3.42%)，较最高的金皇后(4.30%)低20.47%，供试苜蓿材料茎部E排序为：金皇后>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-3>阿尔冈金>GNKH-1>GNKH-2(图3)。茎E/T均低于鸡蛋蛋白(49.7%)模式，只有金皇后高于FAO/WHO模式标准蛋白(35.0%)，金皇后叶E/T和E/N最高(35.95%和56.14%)，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-1是抗寒苜蓿新品系中茎部E/T和E/N最高的(33.22%、49.75%)，较含量最高的金皇后(35.95%和56.14%)低7.60%、11.38%，抗寒苜蓿新品系显著高于俄罗斯西伯利亚杂花和阿尔冈金，由供试苜蓿材料茎部的E/T和E/N可知，供试苜蓿材料茎部蛋白品质排序为：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>俄罗斯西伯利亚杂花>阿尔冈金(图4)。

图3 苜蓿材料茎部T和E(%)Fig.3 The T and E in stem type of alfalfa materials(%)

图4 苜蓿材料茎部E/T和E/N(%)Fig.4 The E/T and E/N in stem type of alfalfa materials (%)

综合分析供试苜蓿材料在高寒阴湿区的茎部蛋白品质表现，GNKH-1、GNKH-3和GNKH-2茎部蛋白品质虽然不及金皇后紫花苜蓿，但均显著高于俄罗斯西伯利亚杂花、阿尔冈金。GNKH-1为适宜高寒阴湿区的茎部蛋白品质最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2仅次GNKH-1。

综上所述，在高寒阴湿区供试苜蓿材料叶部和茎部的蛋白品质表现，GNKH-1仅次于金皇后，为适宜高寒阴湿区的蛋白品质最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2仅次GNKH-1。

2.2 叶和茎氨基酸评分

氨基酸评分指测试蛋白中第一限制性氨基酸的得分，一种蛋白质的氨基酸评分越接近100，表示其含量越接近人体需要，蛋白质的营养价值也越高。将供试苜蓿材料叶部和茎部蛋白质中必需氨基酸含量与1985年WHO必需氨基酸评分模式比较[21]，根据公式(1)计算AAS。

供试苜蓿材料叶部的苏氨酸评分最高，苏氨酸评分排序为：金皇后(127.22)>GNKH-2(123.25)>俄罗斯西伯利亚杂花(122.50)>GNKH-3(122.12)>GNKH-1(110.30)>阿尔冈金(108.55)，金皇后苏氨酸评分(127.22)显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-2次之。供试苜蓿材料叶部的组氨酸和含硫氨基酸的AAS是最低的，其中金皇后和阿尔冈金叶组氨酸评分最低，分别为33.92、33.05，表明组氨酸是它们的第一限制性氨基酸；GNKH-1、GNKH-2、GNKH-3和俄罗斯西伯利亚杂花叶部含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)评分最低，分别为29.81、32.07、32.74、33.05，表明含硫氨基酸是它们的第一限制性氨基酸。金皇后叶部的AAS是最高的(33.92)，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中叶部AAS最高的(32.74)，仅比金皇后低3.47%，供试苜蓿材料叶部AAS排序为：金皇后>阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1(图5)。

综合分析在高寒阴湿区供试苜蓿材料叶部的氨基酸评分表现，GNKH-3、GNKH-2和GNKH-1均不及所有对照，但是GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中叶部氨基酸评分最高的。

图5 苜蓿材料叶部THR-AAS、AASFig.5 The THR-AAS、 AAS in leaf type of alfalfa materials

供试苜蓿材料茎部的苏氨酸评分也最高，苏氨酸评分排序为：金皇后(60.00)>俄罗斯西伯利亚杂花(55.56)>阿尔冈金(51.02)>GNKH-3(46.67)>GNKH-1(40.00)>GNKH-2(38.89)，金皇后苏氨酸评分(60.00)也显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中茎部苏氨酸的评分最高的。供试苜蓿材料茎部也是组氨酸和含硫氨基酸的AAS是最低的，其中金皇后茎部组氨酸评分最低(20.63)，表明组氨酸是它的第一限制性氨基酸；GNKH-1、GNKH-2、GNKH-3、俄罗斯西伯利亚杂花和阿尔冈金茎部的含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)评分最低，分别为12.94、11.77、16.24、15.88、17.55，表明含硫氨基酸是它们的第一限制性氨基酸。金皇后茎部的AAS最高(20.63)，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中茎部AAS最高的(16.24)，供试苜蓿材料茎部AAS排序为：金皇后>阿尔冈金>GNKH-3>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-1>GNKH-2(图6)。

综合分析在高寒阴湿区供试苜蓿材料茎部的氨基酸评分表现，GNKH-3、GNKH-2和GNKH-1均不及对照金皇后和阿尔冈金，但是GNKH-3是抗寒苜蓿材料中茎部氨基酸评分最高的。

图6 苜蓿材料茎部THR-AAS、AASFig.6 The THR-AAS、 AAS in stem type of alfalfa materials

综上所述，在高寒阴湿区供试苜蓿材料叶部和茎部的氨基酸评分表现，GNKH-3、GNKH-2和GNKH-1虽然不及对照金皇后和阿尔冈金，但是GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中氨基酸评分最高的。

2.3 必需氨基酸指数分析

供试苜蓿材料中阿尔冈金叶部的EAAI值最高，为1.2809，显著高于其他品种(P<0.05)，GNKH-1(1.279 9)次之，也显著高于其余品种，金皇后最低(1.276 3)，仅低于最高的阿尔冈金0.36% ，供试苜蓿材料叶部的EAAI值大小排序为：阿尔冈金>GNKH-1>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-3>GNKH-2>金皇后。供试苜蓿材料中阿尔冈金茎部的EAAI值也最高，为1.287 8，显著高于其他品种(P<0.05)，俄罗斯西伯利亚杂花(1.282 2)次之，也显著高于其余品种，GNKH-2是抗寒苜蓿新品系中茎部EAAI值最高的(1.281 1)，仅低于最高的阿尔冈金0.52% ，GNKH-3最低(1.279 8)，也仅低于最高的阿尔冈金(1.287 8)0.62%，供试苜蓿材料茎部的EAAI值大小排序为：阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-2>金皇后>GNKH-1>GNKH-3(图7)。

综上所述，供试苜蓿材料叶部和茎部蛋白均为优质蛋白。其中，阿尔冈金和GNKH-1叶部EAAI值最高；GNKH-2茎部EAAI值仅次于阿尔冈金和俄罗斯西伯利亚杂花。

图7 苜蓿材料叶和茎部EAAIFig.7 The EAAI in leaf and stem type of alfalfa materials

3 讨论

供试苜蓿材料中的T、E、E/T、E/N含量在高寒阴湿区的表现均为叶部>茎部，这与姜健[22]在2008年对苜蓿不同部位的氨基酸组成及含量分析得出的结论一致。供试苜蓿材料在高寒阴湿区叶部的E/T均高于FAO/WHO模式标准蛋白(35.0%)，这与何金环[23]测定的苜蓿叶必需氨基酸含量相近，说明供试苜蓿材料中的氨基酸组成平衡，饲用价值价高；在茎部的E/T除了金皇后都低于FAO/WHO模式标准蛋白(35.0%)，与叶部不同，造成原因可能是与不同气候区温度、苜蓿品种和苜蓿不同部位有关。研究中测定的叶部E/T(35%左右)远小于邓蓉[24]测定的苜蓿芽苗的E/T(54%)，表明苜蓿部位不同，氨基酸含量也会不同，苜蓿蛋白质的营养价值也不同。研究中供试苜蓿材料中的T、E、E/T、E/N含量在叶部和茎部均低于刘太宇[25]测定的同生育期(分枝期)黄河滩区苜蓿T、E、E/T、E/N含量，表明苜蓿中的T、E、N、E/T、E/N随着温度的降低而降低，与魏小红等[26]研究的高寒地区几种牧草氨基酸含量随季节温度的动态变化相一致；古世禄[27]也发现海拔过高，气候变得冷凉，温度过低则不适宜谷子氨基酸的合成。

研究中叶部AAS含量均接近于何金玲[28]于2011年测定的苜蓿叶部AAS(30.00)；茎部AAS远低于30，说明茎部的营养价值不高。EAAI是评价蛋白源的营养价值的最重要的方法之一，笔者得出供试苜蓿材料叶部和茎部均为优质蛋白，说明这些苜蓿品种都是青藏高原很好的引种牧草品种，这与何金环用EAAI评价苜蓿叶部为良好蛋白源的结果一致，也与刘青广等[29]、张利平等[30]得出的苜蓿材料是营养价值很高的食用材料的结果也相一致，说明苜蓿叶部蛋白的氨基酸组成平衡性好，与动物体内氨基酸的组成拟合程度高，若与组氨酸和含硫氨基酸饲料合理搭配，可作为优质的蛋白饲料。

总之，苜蓿作为优质牧草，不仅可以直接青饲、调制干草，而且可以用来提取叶蛋白和维生素等，在饲料、食品、保健品和药物上具有巨大的发展潜力和巨大的经济效益，所以如何提高苜蓿的氨基酸含量继而提高苜蓿的营养价值有待我们继续研究。祝美云等[31]分析微量元素锌对苜蓿芽氨基酸提高具有一定促进作用；徐智明等[32]发现氨基酸复合微肥对苜蓿的营养品质也有一定的影响；王俊平等[33]发现生长调节剂DTA-6有效改善了苜蓿草的营养品质。苜蓿氨基酸含量测定及品质改善方法研究及生长调节剂的作用及效果研究等方面将是下一步工作的重点。

4 结论

(1)由E/T和E/N可知，高寒阴湿区供试苜蓿材料叶部蛋白品质排序为：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花；供试苜蓿材料茎部蛋白品质排序为：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>俄罗斯西伯利亚杂花>阿尔冈金。GNKH-1为适宜高寒阴湿区的蛋白品质最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2仅次GNKH-1。

(2) 高寒阴湿区供试苜蓿材料叶部的AAS排序为：金皇后>阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1；供试苜蓿材料茎部的AAS排序为：金皇后>阿尔冈金>GNKH-3>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-1>GNKH-2。GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中氨基酸评分最高的。

(3)高寒阴湿区供试苜蓿材料叶部EAAI值大小排序为：阿尔冈金>GNKH-1>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-3>GNKH-2>金皇后；供试苜蓿材料茎部EAAI值大小排序为：阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花>GNKH-2>金皇后>GNKH-1>GNKH-3。供试苜蓿材料蛋白均为优质蛋白。