直接抗病毒药物清除HCV后肝细胞肝癌发生风险因素的调查研究

纪 冬，熊艺茹，李 冰，李忠斌，牛小霞，邵 清，陈国凤

慢性肝炎、肝硬化（liver cirrhosis, LC）、肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是慢性肝病进展的共同过程，降低HCC的发病率以及提高现有的诊疗水平始终是慢性肝病治疗的终极目标。在全球数以亿计的病毒性肝炎患者中，约35%死于 HCC，而其中1/3是由HCV的慢性感染造成的[1-3]。在中国，近十年来由HCV引发的HCC患者比例明显上升，而中国HCC患者5年生存率不超过20%[4]，给国家和个人都造成了沉重的医疗负担。可喜的是，高效安全的直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents, DAAs）陆续上市，为慢性HCV感染者带来了治愈的希望[5-7]。目前研究已证实DAAs治疗获得持续病毒学应答（sustained virologic response, SVR）的丙型肝炎（丙肝）患者与未获得SVR的丙肝患者相比HCC的发病率降低了76%[8]。但我们仍须认识到，即使DAAs治疗后SVR率高达100%，仍不能完全避免HCC的发生，对于那些具有HCC高危因素的患者，即使HCV得到有效的清除，也须要严密的监测HCC的发生，目前国际已有研究关注这一领域[9-10]，而由于DAAs在中国上市较晚，目前尚未有针对中国患者的类似研究发表。本研究是前瞻性队列研究，目的是探索接受DAAs治疗并获得SVR后的中国丙肝患者发生HCC的高危因素，以针对HCC做到早诊断、早治疗，进一步提高HCC患者的诊治水平，降低病死率。

1 对象与方法

1.1 对象 选取自2015年10月—2017年5月在中国人民解放军总医院第五医学中心就诊的慢性HCV感染者为研究对象，年龄18～70岁，性别不限，初治或既往干扰素治疗无应答或复发，HCV RNA定量检测阳性且同意使用DAAs抗病毒治疗，并获得SVR者。排除标准：①其他原因肝病或合并其他慢性疾病（包括合并HBV、HIV或其他病毒重叠感染，合并自身免疫性疾病、心血管、血液、精神系统疾病）；②肝功能失代偿；③治疗前、治疗期间以及获得SVR后12周之内确诊肝癌的患者；④过敏、妊娠、吸毒者。

1.2 治疗及随访 符合上述条件的患者在我中心进行筛选和随访，在香港天下仁心医疗集团接受治疗。DAAs治疗包括索磷布韦联合达拉他维、来迪帕韦联合索磷布韦、奥比帕利联合达塞布韦（肝硬化患者同时加用利巴韦林），疗程12～24周。基线、治疗期间直至疗程结束12周，每4周进行1次随访；之后每12周进行1次随访。每次随访检测患者肝功能、肾功能、AFP、血常规、血清HCV RNA定量、腹部彩超、肝弹性检测（liver stiffness measurement,LSM）以及生命体征记录。血清HCV RNA定量检测采用COBAS方法（COBAS TaqMan 48分析仪，上海罗氏诊断公司，中国），最低检测下限为15 IU/ml。LSM检测采用瞬时弹性成像仪FT5000（FibroTouch®，无锡海斯凯尔公司，中国）检测，结果以kPa表示。LC诊断标准为腹部影像学检查提示（包括腹部彩超、增强CT或MRI）或肝弹性值提示（LSM＞17.5 kPa）[11-12]。AFP升高或腹部彩超提示肝占位可能者，使用腹部增强核磁共振确诊HCC（若进行手术切除治疗，肝脏病理检查再次确诊）。SVR定义为DAAs治疗结束后12周检测HCV RNA定量低于最低检测下限。进入队列的起始时间为获得SVR，终点为确诊HCC。

2 结 果

2.1 HCC的新发率 共有506例接受DAAs抗病毒治疗且获得SVR的慢性HCV感染者纳入队列，46.2%（234例）为男性，总体平均年龄（49.1±11.8）岁、身体质量指数（body mass index, BMI）为（23.7±3.3） kg/m2、 HCV RNA 定量为（6.1±1.2）log10IU/ml，LC患者占 16.2%（82例），基因1b型占73.3%（371例），中位随访时间36.6个月（最短4.9个月，最长39.0个月），HCC累积3年新发率为5.929%（30例），多数HCC患者的诊断均发生在SVR后的2年之内，第1年及第2年HCC年新发率分别为1.186%以及3.476%，第3年HCC新发数较第2年明显下降，目前尚未完成第4年的随访（表1）。

表1 DAAs治疗后获得SVR患者HCC的年新发率及累积新发率Table 1 New annual incidence and cumulative incidence of HCC in patients who achieved SVR after DAAs therapy

2.2 患者治疗基线的临床特征 根据是否新发HCC将患者分为新发HCC组与对照组，比较2组患者各项临床指标的差异，结果可见新发HCC组中治疗基线（治疗前）年龄≥55岁，ALB低，AFP高，LSM高，合并糖尿病，血小板低，治疗前已进展至LC例数，与对照组比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。而治疗基线（治疗前）HCV RNA定量及基因型，转氨酶、胆红素水平、肝纤维化改善率在2组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）（表2）。

表2 患者治疗基线（治疗前）的临床特征Table 2 Clinical baseline characteristics of the enrolled patients (before therapy)

2.3 生存分析 将上述单因素分析中有差异的定性临床指标视为分组因素，将患者分为高危组和低危组，进行生存分析，组间差异使用Log-rank检验，进一步进行自变量筛选（图1）。

图1 高危因素患者HCC累积新发率Figure 1 Cumulative new HCC incidence in patients with high risk factors

2.4 HCC新发的高危因素 将筛选的高危因素进行多因素COX比例风险回归分析，结果显示在治疗基线时合并糖尿病、年龄≥55岁、血小板低于正常值下限以及合并LC（LSM＞17.5kPa）为HCC新发的高危因素（图2）。

图2 DAAs治疗后获得SVR患者新发HCC的高危因素分析（COX回归采用Breslow方法）Figure 2 Analysis on high-risk factors associated with new HCC incidence in patients who achieved SVR after DAAs therapy (COX regression analysis by Breslow method)

3 讨 论

DAAs的获批及上市，开启了丙肝治疗的新时代，其高效、耐受性好及较宽的适应证使得失代偿期LC患者得到了治疗机会，强化了治愈丙肝的信心。然而针对DAAs治疗是否能降低HCC发生风险这一主题目前还在争论之中[13-14]，Reig等[15]认为DAAs治疗获得SVR后，HCC新发率并未明显下降，而HCC复发率依然较高。另外的研究分析了此种现象的可能机制，HCV感染会激活肝脏中最普遍的先天免疫NK细胞，发挥免疫监控功能达到保护肝脏的目的，而DAAs治疗迅速清除HCV，肝脏免疫学、分子微环境和肿瘤抑制机制发生剧烈变化，CXCL10和CXCL11表达水平下调，NK细胞表型和功能正常化，导致免疫监控的突然撤离，无法清除新发癌变细胞、允许甚至推动既往未能诊断的微型HCC病灶生长及扩散，临床表现为HCC新发或复发加速。也有研究认为DAAs调节的血管内皮生长因子增加也可能会促进HCC的新发和复发[16-20]。然而之后更多的研究表明DAAs方案与干扰素方案相比，HCC发生率是相似的，并且提出相对于治疗方案本身，基线高危因素才是发生HCC风险的确定因素[21-23]。

本课题组在2017年欧洲肝病年会上公布了中国感染HCV基因1b型患者的数据，DAAs治疗获得SVR后1年HCC发生率为1.5%，与干扰素治疗组的差异无统计学意义[24]。本研究继续随访上述队列，中位随访时间延长至36个月，且纳入符合条件的新患者，样本量从324例增加至506例，基因型从仅有的1b型扩展至1b/2a/3b型等，结果更为可靠。研究显示获得SVR后HCC的3年累积发病率为5.9%，其中76.7%发生于SVR后2年之内，这一现象也符合免疫监控撤离的机制。免疫监控撤离是由于HCV快速清除介导的，随着时间的延长，对HCC的免疫监控功能逐渐恢复，从第3年起发病率逐渐下降。与以往的研究不同[25-26]，本研究排除了治疗前、治疗中及获得SVR后12周内诊断的HCC病例，很大程度上排除了预存HCC微病灶对于后期统计结果的影响；另外本研究的患者来自同一个中心，相对于那些来自多中心的研究而言，可以减少长期随访中由种群异质性引起的偏倚。研究结果提示HCV清除后2年之内，HCC监测仍然是非常必要的。

单因素分析显示HCV RNA定量及基因型，转氨酶、胆红素水平与SVR后肝纤维化的改善不是HCC的高危因素，而进展至HCC的患者，治疗基线时血清ALB低、AFP高、血小板低于正常值下限、LSM＞17.5 kPa 、合并糖尿病、年龄≥55岁的比例较高（相对于无HCC的患者差异有统计学意义），对上述参数进行COX风险比例回归模型分析，结果显示治疗基线时合并糖尿病（HR 3.5）、年龄≥55岁（HR 5.1）、血小板低于正常值下限（HR 8.2）以及LC（LSM＞17.5 kPa，HR 8.8）为HCC新发的高危因素，此结果是迄今为止关于中国患者获得SVR后HCC发病率最长随访时间的数据，与国外研究的结论一致[27-28]，强调由于DAAs缺乏抗肿瘤作用，甚至是抑制免疫监控功能，即使是HCV得到清除的丙肝患者，HCC风险仍然持续存在，所以严密的HCC监测是必要的，尤其是那些具有高危因素的个体，可以为精准诊断、治疗肝癌提供可靠依据。

综上所述，本研究结果表明，接受DAAs治疗的患者HCV根除后，仍可能存在较高HCC新发率，建议对具有高危因素的个体（治疗基线时合并糖尿病、年龄≥55岁、存在LC以及血小板低于正常值）进行严密的HCC监测，尤其是在获得SVR后的2年以内，这一点至关重要。另外也须要认识到，目前仍需更多的临床研究来证实HCC的发生与DAAs治疗的关系，从而制定出更好的诊治以及监测随访方案以降低HCC 的病死率。