双抗原夹心法和间接法检测丙型肝炎病毒抗体对比研究*

孙 强，李艳琴，何宝明

陕西省汉中市中心医院检验科 (汉中 723000)

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染是在世界范围内广泛分布的传染性疾病，卫生组织统计显示全球感染者数量约1.85亿，感染率2.8%，且每年约35万人因此发生死亡，亚太地区HCV患病率为0.1%～4.7%，其中我国丙型肝炎患者数量最多，共计约1000万人[1-3]。随着病情进展，约一半HCV感染者可逐渐转变为慢性肝炎甚至引起肝硬化或肝细胞癌，我国HCV主要传播途径为血液和血制品，抗-HCV抗体检测是目前早期诊断和血液筛查主要手段，不仅有利于切断输血传播途径和保障临床用血安全，还可加强HCV感染者早期防治，故加强检测质量管理极为重要[4-5]。酶联免疫吸附试验(Enayme liked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光法及时间分辨荧光免疫分析法等均是抗HCV检测常用方法且多采用间接ELISA法，但因抗原制备和试剂生产工艺影响，常存在假阳性和漏检等局限性，双抗原夹心法是以酶标记抗原代替间接法中酶标记二抗的检测方法，可检测包括IgG和IgM在内的总抗体，近年来在乙肝抗体、梅毒抗体及HIV抗体中均成功应用[6-9]。本文主要研究双抗原夹心法和间接法检测丙型肝炎病毒抗体的结果，为寻找更为准确有效的检测方法提供依据。

资料与方法

1 研究对象 选取2018年4月至2019年4月我院输血前、术前及孕前拟行HCV抗体检测的患者1674例，其中男性851例(50.84%)，女性823例(49.16%)，年龄18～94岁，平均(52.71±13.06)岁。

2 试剂和仪器 addcare ELISA 1100全自动酶免分析系统(山东烟台生物科技有限公司)；Genesis RSP150加样系统(瑞士TECEN公司)；北京拓普DEM-3洗板机；间接法ELISA诊断试剂盒(上海科华，生产批号为201709422；英科新创，批号为2016047583)；双抗原夹心ELISA试剂(北京万泰，批号为CS20150928)，所有试剂盒均经卫生部门检验合格且在有效期内。且均在有效期内使用。

3 研究方法

3.1 样本采集：采用促凝管取患者空腹肘静脉血5 ml，以3000 r/min离心10 min后取上清分装于无热源的EP管中-20℃保存。

3.2 精密度验证：取高、中、低三个浓度样本重复检测20次(孔)并计算吸光度值/临界值(S/CO)均值、标准差及批内变异系数；另取高、中、低三个浓度样本检测单孔，重复检测20 d并计算S/CO均值、标准差及批间变异系数。

3.3 检测原理：①间接ELISA法：提前将HCV抗原肽片段包被于聚苯乙烯微孔板微孔板，实验时向微孔中分别加入样本，其中的抗-HCV抗体会与相应抗原结合，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素为示踪剂，充分洗涤后加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在HRP酶催化下显示为蓝色，继而酸化成黄色，且颜色的深浅与样本中抗-HCV抗体浓度呈正相关性，采用用酶标仪在450 nm处测定S/CO即可计算样品浓度。②双抗原夹心ELISA法：用纯化抗-HCV抗体包被微孔板，然后向包被单抗的微孔中依次加入HCV抗原肽片段，再与HRP标记的HCV抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经彻底洗涤后加入TMB显色，先HRP酶催化下转化成蓝色，最终在酸的作用下转化成黄色，且颜色深浅与样品中抗-HCV抗体表达水平呈正相关，用酶标仪在450 nm波长下测定S/CO并计算样品浓度。

3.4 检测过程：将所有试剂和样本缓慢恢复至室温(18～25℃)，设置7个标准样品孔，分别加入100μl按比例稀释的不同标品，零孔中加100 μl标准品，其它孔中加入100 μl检测样品，酶标板加上覆膜后37℃反应2 h，去液并甩干后再向各孔加检测溶液1工作液100 μl，在相同条件下反应1 h，甩干孔内液体并用350 μl洗涤液浸泡1～2 min后进行充分洗涤3次，最后1次洗涤时需将孔内洗涤液完全甩干，完成后每孔加检测溶液2工作液100 μl，酶标板加上覆膜后在37℃下反应30 min，之后重复甩干、洗板5次，再向各孔加入90 μl底物溶液，酶标板加上覆膜后在37℃下避光显色反应，充分显色后所有孔加入终止液50 μl终止反应。确认酶标板底无水滴且孔内无气泡后立即在450 nm波长用酶标仪测量各孔S/CO值即为抗-HCV抗体表达水平。

3.5 确证实验：三种检测试剂种任意两种阳性为阳性，单一试剂阳性者进行核酸检测(NAT)阳性为阳性，否则均为阴性，计算间接ELISA法和双抗原夹心ELISA法对HCV检出率并比较两种检测方法灵敏度和特异度。

结 果

1 三种试剂对HCV检测结果比较 上海科华间接法、英科新创间接法和北京万泰双抗原夹心法HCV检出率分别为4.30%、4.06%和3.52%(P>0.05)，三种检测试剂S/CO比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 三种试剂对HCV检测结果比较

2 间接ELISA法诊断准确性 以确证实验结果为“金标准”，间接ELISA法检测HCV灵敏度为94.00%，特异度为98.27%，阳性预测值为62.67%，阴性预测值为99.81%，准确率为98.15%，一致性Kappa为0.743。

表2 间接ELISA法诊断准确性分析(例)

3 双抗原夹心ELISA法诊断准确性 以确证实验结果为“金标准”，双抗原夹心ELISA法检测HCV灵敏度为97.91%，特异度为99.26%，阳性预测值为79.66%，阴性预测值为99.94%，准确率为99.22%，一致性Kappa为0.875。

表3 双抗原夹心ELISA法诊断准确性分析(例)

4 间接法和双抗原夹心法检测HCV一致性 McNemar检验结果显示，间接法和双抗原夹心法检测HCV结果差异有统计学意义(χ2=6.095，P<0.05)。

表4 间接法和双抗原夹心法检测HCV一致性分析(例)

讨 论

早期HCV感染常缺少典型症状，容易在不知情下通过手术或献血等途径造成传播和感染，对人类健康造成巨大危害，因此输血前、术前和孕前HCV检测已在各级医院普遍展开，目前临床常用检测方法包括核酸扩增试验法、化学发光法以ELISA法等[10]。由于HCV基因序列突变而导致编码的氨基酸序列大幅度改变，且国内感染者常为多种基因系HCV混合感染，导致核酸扩增试验早期诊断效果欠佳；化学发光法敏感性及特异性较高且检测速度快，但成本偏高，难以作为常规检测方法开展[11-12]。

ELISA法对HCV抗体检出率可达99.0%，其中间接ELISA法是目前国内外抗-HCV抗体检测应用最广泛的方法，但容易受污染出现假阳性，且采用间接法原理检测的ELISA诊断试剂盒为人工合成或基因工程制造的固相多肽抗原，检测结果常因生产厂商不同而存在明显差异[13-14]。我国《血站操作技术规程》规必须采用两家ELISA抗体诊断试剂对献血者进行筛查，目前常用抗原包括HCV-core、NS3、NS4及NS5等，但由于间接法本身的局限性导致仍难以完全避免假阳性和漏检发生，为避免血液资源浪费和防止HCV经输血传播，寻找更为准确有效的HCV筛查方法势在必行[15-16]。随着丙型肝炎重组抗原技术进步，双抗原夹心法作为新型检测手段近年来也逐渐推广，虽然与间接法基本原理均为免疫性诊断，但检测过程和所用试剂盒不同[17]。本研究比较两种检测方法三种ELISA诊断试剂对HCV检出率显示，上海科华间接法、英科新创间接法和北京万泰双抗原夹心法检出率分别为4.30%、4.06%和3.52%且三种检测试剂S/CO无明显差异，表明不同试剂对HCV检出率基本相同，但由于假阳性和假阴性存在，此结果尚不足以判断各种试剂优劣。

间接ELISA法采用HRP标记抗-IgG抗体为第二抗体酶结合物，因血清中IgG产生的时间相对较晚，故而用于HCV早期筛查和诊断存在一定漏检可能性，同时由于部分非特异性物质吸附，检测结果又可能产生假阳性[18]。随着基因工程应用和生产工艺改进，ELISA诊断试剂盒质量不断提升，但由于窗口期和患者免疫功能影响，仍难以完全避免漏检情况发生[19]。与间接ELISA法相比，双抗原夹心ELISA法检测抗-HCV抗体包括IgG和IgM的总抗体，且反应时不受IgG亚型影响，有利于缩短HCV感染“窗口期”，提升早期感染患者检出率，同时双抗原夹心法采用两种重组抗原分别标记生物素及吖啶酯，可有效减少类风湿因子及非特异抗体的干扰，从而减少假阳性产生[20]。陕柏峰[21]等研究显示双抗原夹心ELISA法检测HCV结果与确证实验符合率达96.60%，假阳性率较间接法明显降低且稀释实验理论检测下限≥0.007NCU/ml。周齐洋等[20]研究认为双抗原夹心ELISA法特异性和早期感染监测能力明显优于间接ELISA法，因此有望成为HCV检测主要方法。本研究结果显示，间接法和双抗原夹心法用于HCV检测灵敏度分别为94.00%和97.91%，特异度为分别为98.27%和99.26%，阳性预测值分别为62.67%为79.66%，阴性预测值分别为99.81%和99.94%，准确率分别为98.15%和99.22%，一致性Kappa为0.743和0.875，可见双抗原夹心ELISA法在灵敏度和特异度方面均具有一定优势，诊断准确率较间接法明显提升，用于早期感染诊断可有效避免漏诊或误诊，对及时干预和改善患者预后具有重要意义。周奕等[22]对198例慢性丙型肝炎患者临床资料进行研究显示，HCV感染途径包括输血、静脉药瘾和性接触等，且输血为主要传播方式。因此双抗原夹心ELISA法用于血液样品筛查则有利于减少漏检和假阳性，及避免血液资源浪费，又可有效控制HCV经输血途径传播，从而降低感染率和控制疾病流行。此外本研究采用McNemar检验比较双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法对HCV检出率一致性显示，两者差异有统计学意义，表明双抗原夹心法用于HCV检测较间接法具有较大优势，可明显提升HCV早期筛查和诊断准确性。

综上所述，双抗原夹心ELISA法用于HCV检测灵敏度和特异度均明显高于间接ELISA法，对控制HCV感染和传播具有较高临床价值和应用前景。