风湿定胶囊治疗类风湿关节炎模型大鼠的相关机制研究

王景靓，徐晓峰，张家国

（辽宁省大连市第二人民医院骨科，辽宁 大连 116011）

类风湿关节炎（RA）属常见自身免疫性疾病，主要病理表现为多个关节滑膜的炎症、增生等，如不及时有效地治疗，随着病情的不断进展，会出现不同程度的关节畸形及活动功能障碍[1]。近年来，中医药低毒性及多靶点治疗的特点越来越受到重视，已成为研发治疗RA药物的新靶点[2]。风湿定胶囊具有补气养血、扶正祛邪、驱寒除湿等功效，能治疗RA及坐骨神经痛等病症，其作用机制可能与其能调节Janus激酶／信号转导子与转录激活子（JAK ／STAT）信号通路有关[3]。JAK ／STAT 信号通路属诸多细胞因子发生信号转导的一个共同途径，能广泛地参与到细胞增殖、分化、凋亡，以及机体的炎性反应过程，并能依靠负调节因子同其他信号通路发生相互作用，还可通过STATs的共价修饰途径实施信号调节。此信号通路能促使各类炎症类疾病的形成和发展，对其实施靶向治疗逐渐成了当前研究的重要方向。本研究中探讨了风湿定胶囊治疗RA的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

动物：SPF级健康未交配性成熟的雄性Wistar大鼠100只，体质量为 180～220g，足趾容积为 1.70～2.30mL，购自广州中医药大学，动物合格证号为 SYXK（粤）2014-0144，予以标准饲料和水饲养，保证生存室温为18～22℃，相对湿度为40% ～50%。本试验经医院试验动物伦理委员会审批。

试药：风湿定胶囊（陕西健民制药有限公司，国药准字 Z20044165，规格为每粒 0.3 g）；Ⅱ型胶原（规格为每支10 mg），完全弗氏佐剂，均购自大连宝生物工程有限公司。

仪器：总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，实时荧光定量PCR试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司)；p-JAK3及p-STAT3单抗购自上海康朗生物科技有限公司；荧光定量PCR仪（南京贝登医疗股份有限公司）；Western Blotting相关试剂盒（上海英拜生物科技有限公司）。

1.2 方法

动物分组：根据随机数字表法将大鼠分为5组，分别为空白对照组(A组)，模型组(B组)，风湿定胶囊低、中、高剂量组(C1组，C2组，C3组)，每组 20 只。

风湿定胶囊灌胃溶液配制：按照不同剂量取风湿定胶囊加入0.9%氯化钠注射液中，制成混悬液，低、中、高剂量分别为 10，20，40 g／L，给药体积为每 100 g体质量2 mL。大鼠的风湿定胶囊灌胃浓度根据体表面积法，以临床成人给药剂量计算。

CⅡ乳剂配置：无菌条件下用0.1 mol／L冰乙酸充分溶解Ⅱ型胶原，随后置4℃冰箱过夜。于次日取出，加入等体积完全弗氏佐剂混合，经振荡乳化得CⅡ乳剂，置4℃冰箱保存。

RA模型大鼠制备：采用10%水合氯醛麻醉处理，选择大鼠背部及左右足跖多点皮下注射0.5 mL CⅡ乳剂。A组与B组予等量生理盐水，C1组，C2组，C3组分别予200，400，800 mg／（kg·d）的风湿定胶囊，连续给药 4 周。

p-JAK3及p-STAT3蛋白表达水平检测：提取各组大鼠的关节滑膜组织，置研钵内，添加300 μL的裂解液，研磨10 min，再充分振荡后放置10 min，4℃下以14 000 r／min离心 10 min，获得上清总蛋白，通过 BCA法测定蛋白浓度，再提取适量的总蛋白，通过5倍的上样缓冲液稀释后，置95℃条件下5 min。再将变性蛋白置120 g／LSDS-PAGE内实施电泳，并添入一抗 p-JAK3和p-STAT3，4℃下与辣根过氧化酶发生结合的山羊抗兔共同孵育过夜，通过BeyoECL Plus发光测定，完成后清除免疫印迹，测定甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，有关操作步骤同上。利用图像分析软件对条带实施灰度分析，将二者的蛋白灰度比记为表达水平。

1.3 观察指标

比较给药后 0，7，14，21，28 d 时各组大鼠的体质量与足部肿胀体积变化情况，对比给药4周后各组大鼠的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平。

1.4 统计学处理

采用 SPSS 20.0统计学软件处理。计数资料以率（%）表示，行 χ2检验。计量资料以 X±s表示，行 t检验；多组间的计量资料比较实施方差分析，计算 F值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见表1和表2及图1。

表1 各组大鼠不同时间点体质量和足部肿胀体积比较（X±s，n＝20）

表2 各组大鼠滑膜组织中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平比较（s，n＝20）

表2 各组大鼠滑膜组织中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平比较（s，n＝20）

组别A组B组C1组C2组C3组F值P值p-JAK3蛋白0.59 ± 0.04＃1.90 ± 0.15 1.31 ± 0.12＃1.15 ± 0.11＃0.87 ± 0.07＃7.885 0.000 p-STAT3蛋白0.68 ± 0.13＃2.76 ± 0.21 1.70 ± 0.18＃1.33 ± 0.12＃0.93 ± 0.10＃10.691 0.000

图1 各组大鼠滑膜组织中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平

3 讨论

RA患者普遍存在不同程度的关节功能障碍，加之免疫系统失调，极易导致感染性疾病及心血管疾病[4-5]。目前，临床主要采用激素类药物治疗，但长期服用极易引发不良反应，降低患者的依从性及耐受性，不利于预后[6]。RA中医治疗主要是从病机根源“痹病”出发，辨证施治，且以扶正驱邪为主要原则。目前，中医针对RA的治疗常用有清热解毒、活血化瘀、祛风散寒等功效的复方药，虽然临床疗效明显，但其具体的作用机制尚未完全明确。

本研究结果显示，A组和风湿定胶囊给药组大鼠于7，14，21，28 d时的体质量均比B组高，且随着风湿定胶囊剂量的不断增加呈逐渐增长趋势。风湿定胶囊方中，甘草清热解毒、补气益脾、和中缓急，八角枫祛风除湿、散瘀止痛、舒筋活络，徐长卿祛风止痛、止痒消肿，白芷祛风除湿、活血排毒、生肌止痛，诸药联用，共奏镇痛、抗炎、消肿及活血通络功效，可有效改善RA的预后。A组和风湿定胶囊给药组大鼠7，14，21，28 d时的足部肿胀体积均比B组低，且随着风湿定胶囊剂量的不断增加而逐渐降低，表明风湿定胶囊有利于降低大鼠的足部肿胀体积，主要原因与风湿定胶囊能有效改善关节滑膜组织增生、炎症有关。

A组和风湿定胶囊给药组大鼠滑膜组织中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平均比B组低，且随着风湿定胶囊剂量的不断增加而呈逐渐降低趋势，这与文献[7-8]报道相符，提示风湿定胶囊可有效降低RA大鼠滑膜组织中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平与其能调节Janus激酶／信号转导子与转录激活子（JAK ／STAT）信号通路等因素有关。JAK ／STAT 信号通路是哺乳动物机体中较常见的一种信号转导途径，通常含有4个JAKs及7个STATs，其中JAKs属非受体类酪氨酸激酶，主要有 JAK1，JAK2，JAK3，Tyk2 等成员，相对JAK3存在7个保守性结构域，不含跨膜结构域，其C-末端的JH1和JH2域存在催化功能，而N-末端所含4个JH域不存在酪氨酸激酶的活性，但可能参与到JAKs和其他有关的信号蛋白分子互相结合过程[9-11]。STATs源自研究干扰素的信号转导机制过程，其主要包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，5aSTAT，5bSTAT，STAT6等成员。STAT3是常见的家族蛋白成员，其所含有的C-末端残基构成了转录激活域，并与其他STATs成员间具有较大差异，因此可促使其与RA有关的其他转录调节信号发生联系[12-13]。此信号通路是人体内重要的多功能细胞因子转导通路，参与了体内细胞增殖分化、炎性反应、免疫调节等多种病理生理过程，并与RA的发生及进展有关。研究发现，RA大鼠治疗后关节滑膜组织中的 JAK3及 STAT1等均存在显著降低[14]。风湿定胶囊可能正是通过下调组织滑膜中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平调控JAK／STAT信号通路，发挥治疗RA的作用。

综上所述，风湿定胶囊治疗RA模型大鼠的可能机制为下调组织滑膜中p-JAK3和p-STAT3蛋白表达水平，参与JAK／STAT信号通路的调控过程，进一步发挥治疗作用。