不同种源三叶崖爬藤表型多样性分析

杨 旭， 杨志玲，①， 程小燕， 谭 美

(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所， 浙江 杭州 311400； 2. 浙江省林木育种技术研究重点实验室， 浙江 杭州 311400)

植物的表型包括植物性状、组织结构以及有效成分的组成和含量等[1]，是基因型对外界环境变化的适应性响应，是植物在长期的选择压力下产生的不可逆变化并可稳定遗传[2]。表型变异在物种进化和生态适应上有重要意义，对表型变异的研究有助于了解遗传因子和环境因子对植物群体的影响。同质园实验(common garden experiment)是将不同种源的个体引种栽培在同一地点，保证其生境一致，剔除表型变异中的环境效应，检测种源间表型变异是否为适应环境的结果[3]。由于植物表型变异的影响因子错综复杂，通过同质园实验来揭示表型性状与遗传背景和生态环境间的相互关系有重要意义。

三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)隶属于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤属〔Tetrastigma(Miq.) Planch.〕[4]，为中国特有的民间药用植物，其主要有效成分包括黄酮类、多酚类、多糖类、三萜类和脂肪酸类等化合物[5]。其中，黄酮类化合物具有显著的抗氧化[6]、抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡[7]以及抑制肿瘤细胞生长的作用[8]；多糖类化合物能解热抗炎[9]，提高肝细胞氧化能力，对急慢性肝损伤有明显的拮抗作用[10]。这与三叶崖爬藤具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎镇痛和解热保肝等功效相符[11]，可作为三叶崖爬藤的考察指标。

三叶崖爬藤为广布种，主要分布于中国的亚热带地区，在南部热带和亚热带岛屿也有少量分布，生长于海拔300～1 300 m的灌丛、山谷溪边和林下岩石缝中[4]。生长环境的异质性会造成植物表型的多样性。目前，对不同种源三叶崖爬藤表型变异的报道还较少[12]，已有研究对不同种源三叶崖爬藤块茎中化学成分进行了比较[13-15]，但多采用野生种源，比较化学成分含量时不能排除生长年限、采收季节及生长地的地理气候条件对药材生长性状及品质的影响。本研究选用同质园栽培的不同种源三叶崖爬藤为研究对象，通过对不同种源三叶崖爬藤农艺性状及块茎中总黄酮和多糖含量的比较，分析其表型多样性及表型分化情况，以期为三叶崖爬藤资源的保护和可持续利用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验地概况

实验地位于浙江省绍兴市平水镇的三叶崖爬藤栽培基地，地理位置为北纬29.70°、东经120.68°。实验地处于中纬度亚热带北缘的过渡地带，属典型的季风性湿润气候区，全年温暖湿润，四季分明，年均温16.9 ℃，极端最高温44.1 ℃，极端最低温-10.2 ℃，年均降水量1 403.0 mm，年均空气相对湿度在80%以上，无霜期237 d。

1.2 材料

收集来自5个省(自治区)14个种源的三叶崖爬藤块茎，各种源地的地理信息见表1。于2013年9月至10月以不同种源块茎上萌发的生长健壮的三叶崖爬藤植株当年生茎段为插穗进行扦插繁殖，繁殖方法参照文献[16]。

表1 三叶崖爬藤种源地的地理信息

Table 1 Geographical information of provenance locations ofTetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg

种源Provenance纬度Latitude经度Longitude海拔/mElevation湖南汝城Rucheng of HunanN23.54°E113.68°578湖南沅陵Yuanling of HunanN28.74°E110.38°623湖南泸溪Luxi of HunanN28.89°E110.73°471湖北咸丰Xianfeng of HubeiN29.68°E109.15°289江西瑞金Ruijin of JiangxiN25.88°E116.03°255江西弋阳Yiyang of JiangxiN28.42°E117.43°294广西乐业Leye of GuangxiN24.78°E106.56°335广西天峨Tiane of GuangxiN24.70°E108.06°186浙江磐安Panan of ZhejiangN29.05°E120.43°246浙江平阳Pingyang of ZhejiangN27.68°E120.55°336浙江温岭Wenling of ZhejiangN28.37°E121.37°296浙江淳安Chunan of ZhejiangN29.61°E119.05°158浙江绍兴Shaoxing of ZhejiangN30.00°E120.57°397浙江遂昌Suichang of ZhejiangN28.59°E119.25°473

于2014年4月12日将扦插苗定植于营养钵(直径30 cm、高30 cm)内，每个营养钵栽植1株。栽培土壤为园土，土壤质地为沙壤土，pH 6.65，总有机质含量26.25 g·kg-1，全钾含量414.20 g·kg-1，速效钾含量127.20 mg·kg-1，全氮含量1.14 g·kg-1，速效氮含量102.07 mg·kg-1，全磷含量1.38 g·kg-1，速效磷含量62.17 mg·kg-1。每种源3个重复，每个重复30个营养钵。采用常规的栽培方法和田间培育措施，光照强度为全光照的30%，每日叶面喷水2次，保持土壤湿润。

1.3 方法

于2017年10月生长基本停止时使用游标卡尺(精度0.02 mm)测量三叶崖爬藤植株的茎粗(距地面约1.2 m处)，使用直尺(精度0.1 cm)测量新稍长。选取三叶崖爬藤植株中部成熟叶片，使用LC1200叶面积测定仪(浙江托普仪器有限公司)测量叶长、叶宽和叶面积。挖取栽培3 a的三叶崖爬藤的块茎，洗净并擦干表面水分后，统计单株块茎数量，使用游标卡尺测量块茎直径，使用万分之一电子天平称量单株块茎鲜质量。以上表型性状每个种源测量30株植株。

将挖出的块茎阴干，去除须根，粉碎，过40目筛，备用。采用分光光度法[17]测定总黄酮含量，采用苯酚-硫酸法[18]测定多糖含量，均重复测定2次。

1.4 数据分析

采用EXCEL 2013软件对实验数据进行初步分析，采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Pearson相关性分析，并对各种源进行UPGMA聚类分析。

2 结果和分析

2.1 不同种源三叶崖爬藤表型性状分析

不同种源三叶崖爬藤的表型性状见表2。由表2可知：14个种源三叶崖爬藤的茎粗为1.20～2.48 mm，其中，江西瑞金种源的茎最粗，浙江平阳种源的茎最细；14个种源三叶崖爬藤的新稍长为9.0～13.4 cm，其中，江西弋阳种源的新稍最长，浙江磐安种源的新稍最短；14个种源三叶崖爬藤的叶长为4.63～7.37 cm，其中，广西天峨种源的叶片最长，浙江磐安种源的叶片最短；14个种源三叶崖爬藤的叶宽为2.05～4.01 cm，其中，湖南汝城种源的叶片最宽，浙江平阳种源的叶片最窄；14个种源三叶崖爬藤的单叶面积为10.08～23.85 cm2，其中，广西乐业种源的叶片最大，浙江平阳种源的叶片最小；14个种源三叶崖爬藤的单株块茎数量为3.5～5.7，其中，浙江磐安种源的单株块茎数量最多，江西瑞金种源的单株块茎数量最少；14个种源三叶崖爬藤的块茎直径为8.82～33.00 mm，其中，湖北咸丰种源的块茎直径最大，浙江淳安种源的块茎直径最小；14个种源三叶崖爬藤的单株块茎鲜质量为7.81～34.62 g，其中，湖南泸溪种源的单株块茎鲜质量最大，浙江温岭种源的单株块茎鲜质量最小；14个种源三叶崖爬藤块茎中总黄酮含量为6.03～26.83 mg·g-1，其中，浙江绍兴种源块茎中总黄酮含量最高，江西瑞金种源块茎中总黄酮含量最低；14个种源三叶崖爬藤块茎中多糖含量为106.17～182.65 mg·g-1，其中，浙江绍兴种源块茎中多糖含量最高，湖北咸丰种源块茎中多糖含量最低。方差分析结果表明：三叶崖爬藤10个表型性状中，新稍长和单株块茎数量在种源间的差异不显著，其余表型性状在种源间的差异均达到极显著水平。

种源Provenance茎粗/mmStem diameter新稍长/cmNew shoot length叶长/cmLeaf length叶宽/cmLeaf width单叶面积/cm2Single leaf area湖南汝城Rucheng of Hunan2.06±0.11ab10.8±2.6a5.40±0.84de4.01±0.32a18.32±4.22bcde湖南沅陵Yuanling of Hunan2.03±0.07ab12.7±3.1a5.79±0.44bcde3.91±0.30a20.49±1.42ab湖南泸溪Luxi of Hunan1.91±0.06b13.4±3.8a5.75±0.43cde3.98±0.43a20.02±2.72ab湖北咸丰Xianfeng of Hubei2.08±0.15ab13.1±2.6a5.04±0.42e3.73±0.42ab17.50±2.59bcde江西瑞金Ruijin of Jiangxi2.48±0.67a12.5±2.8a6.44±0.74abcd3.84±0.74ab19.44±4.59abcd江西弋阳Yiyang of Jiangxi2.41±0.48a13.4±3.3a6.86±0.66abc3.61±0.66abc19.97±1.45ab广西乐业Leye of Guangxi1.94±0.10b12.0±2.4a7.07±0.60ab3.14±0.59bcd23.85±1.58a广西天峨Tiane of Guangxi1.85±0.19bc11.9±2.0a7.37±0.52a2.83±0.29def19.72±1.47abc浙江磐安Panan of Zhejiang1.37±0.21c9.0±2.0a4.63±0.45e2.24±0.13ef11.54±2.15f浙江平阳Pingyang of Zhejiang1.20±0.10c9.4±3.0a4.96±0.98e2.05±0.18f10.08±2.16f浙江温岭Wenling of Zhejiang1.30±0.11c9.6±1.4a5.06±0.11e2.07±0.23f10.62±2.07f浙江淳安Chunan of Zhejiang1.25±0.09c10.1±2.2a4.74±0.12e2.31±0.23ef11.12±1.36f浙江绍兴Shaoxing of Zhejiang1.22±0.12c9.6±3.1a5.00±0.60e2.39±0.13def14.59±3.68def浙江遂昌Suichang of Zhejiang1.34±0.18c9.2±1.2a5.55±0.71cde2.67±0.47def14.99±2.69cdef均值Average1.74±0.4911.2±2.65.68±1.003.08±0.8016.66±4.76变异系数/% Coefficient of variation27.9324.1617.6526.0728.59种源Provenance单株块茎数量Tuber number per plant块茎直径/mmTuber diameter单株块茎鲜质量/gTuber fresh mass per plant块茎中总黄酮含量/(mg·g-1)Total flavone content in tuber块茎中多糖含量/(mg·g-1)Polysaccharide content in tuber湖南汝城Rucheng of Hunan4.2±1.1a22.43±3.50bc28.82±3.63ab9.47±1.15fg126.67±9.43de湖南沅陵Yuanling of Hunan4.4±1.6a23.53±6.40abc31.93±5.22a8.45±0.95gh119.20±8.60ef湖南泸溪Luxi of Hunan4.4±1.4a23.61±3.91abc34.62±7.22a12.40±0.71efg125.60±6.11de湖北咸丰Xianfeng of Hubei3.8±1.2a33.00±3.61a31.07±4.38a13.11±0.38ef106.17±8.82f江西瑞金Ruijin of Jiangxi3.5±1.3a29.50±12.28ab20.56±2.69cd6.03±0.68h139.61±7.59d江西弋阳Yiyang of Jiangxi3.6±0.5a32.96±9.00a23.67±3.19bc6.24±0.69h125.14±5.92de广西乐业Leye of Guangxi4.4±0.9a19.31±3.10cd22.21±3.79bc11.51±1.26efg118.58±2.73ef广西天峨Tiane of Guangxi4.4±1.2a26.25±6.32abc18.39±3.08cde11.24±0.68efg121.42±13.35ef浙江磐安Panan of Zhejiang5.7±1.1a10.72±2.50de10.68±3.31d22.25±0.75ab153.47±6.20c浙江平阳Pingyang of Zhejiang4.4±1.1a9.84±1.64de13.59±2.88def17.30±0.77cd166.04±4.81bc浙江温岭Wenling of Zhejiang4.3±1.0a9.03±1.75e7.81±3.71f15.25±1.09de129.78±10.56de浙江淳安Chunan of Zhejiang4.0±1.2a8.82±1.12e10.77±3.09f19.65±0.36bc161.52±7.13bc浙江绍兴Shaoxing of Zhejiang3.7±0.9a10.87±3.31de11.52±1.61ef26.83±0.68a182.65±7.04a浙江遂昌Suichang of Zhejiang4.2±1.3a9.88±3.20de10.24±5.04f20.65±1.22ab169.14±6.56ab均值Average4.2±1.119.27±10.0319.73±9.5914.83±5.67138.60±23.59变异系数/% Coefficient of variation25.8151.9548.5938.2317.03

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(p<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (p<0.05) difference.

10个表型性状中，块茎直径和单株块茎鲜质量的变异系数较大，分别为51.95%和48.59%，其余表型性状的变异系数在17.03%～38.23%之间，表明各表型性状在种源间存在一定程度的多样性。

2.2 不同种源三叶崖爬藤的聚类分析

根据10个表型性状对14个种源三叶崖爬藤进行聚类分析。结果(图1)显示：在欧氏距离12.5处，14个种源聚为2类，其中，浙江6个种源聚为一类，这类三叶崖爬藤的茎较纤细，叶片狭而短，单叶面积较小，块茎直径和单株块茎鲜质量较小，但块茎中总黄酮和多糖含量总体上较高；其他8个种源聚为另一类，这类三叶崖爬藤的茎粗壮，叶片较宽且长，单叶面积较大，块茎直径和单株块茎鲜质量较大。

2.3 三叶崖爬藤表型性状间的相关性分析

三叶崖爬藤表型性状间的相关系数见表3。由表3可知：除叶长与叶宽、单株块茎鲜质量和块茎中多糖含量以及单株块茎数量与其他各表型性状的相关性不显著外，三叶崖爬藤其他表型性状间均呈显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)相关。其中，块茎直径和单株块茎鲜质量与茎粗、新稍长、叶宽和单叶面积呈极显著正相关，块茎中总黄酮和多糖含量与茎粗、新稍长、叶长、叶宽、单叶面积、块茎直径和单株块茎鲜质量总体上呈极显著负相关。

LY： 广西乐业Leye of Guangxi； TE： 广西天峨Tian’e of Guangxi； RC： 湖南汝城Rucheng of Hu’nan； YL： 湖南沅陵Yuanling of Hu’nan； LX： 湖南泸溪Luxi of Hu’nan； YY： 江西弋阳Yiyang of Jiangxi； XF： 湖北咸丰Xianfeng of Hubei； RJ： 江西瑞金Ruijin of Jiangxi； PY： 浙江平阳Pingyang of Zhejiang； SC： 浙江遂昌Suichang of Zhejiang； CA： 浙江淳安Chun’an of Zhejiang； PA： 浙江磐安Pan’an of Zhejiang； SX： 浙江绍兴Shaoxing of Zhejiang； WL： 浙江温岭Wenling of Zhejiang.图1 不同种源三叶崖爬藤的聚类图Fig. 1 Cluster diagram of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from different provenances

表3 三叶崖爬藤表型性状间的相关系数1)

Table 3 Correlation coefficient among phenotypic characters ofTetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg1)

表型性状Phenotypic character相关系数 Correlation coefficientSDNSLLLLWSLATNTDTFMTFCPCSD1.000NSL0.892**1.000LL0.651*0.627*1.000LW0.886**0.833**0.4241.000SLA0.812**0.808**0.801**0.780**1.000TN-0.287-0.348-0.102-0.289-0.1551.000TD0.949**0.932**0.572*0.843**0.742**-0.3581.000TFM0.785**0.839**0.3430.941**0.750**-0.1780.792**1.000TFC-0.893**-0.812**-0.664**-0.761**-0.692**0.220-0.799**-0.708**1.000PC-0.725**-0.773**-0.498-0.666**-0.655*-0.005-0.720**-0.723**0.791**1.000

1)SD： 茎粗Stem diameter； NSL： 新稍长New shoot length； LL： 叶长Leaf length； LW： 叶宽Leaf width； SLA： 单叶面积Single leaf area； TN： 单株块茎数量Tuber number per plant； TD： 块茎直径Tuber diameter； TFM： 单株块茎鲜质量Tuber fresh mass per plant； TFC： 块茎中总黄酮含量Total flavone content in tuber； PC： 块茎中多糖含量Polysaccharide content in tuber. *：p<0.05； ** ：p<0.01.

3 讨 论

表型性状既有变异性又有稳定性，是植物基因型和环境综合作用的体现。本研究中，三叶崖爬藤叶片表型性状种源间变异为17.65%～28.59%，同为药用藤本植物的何首乌〔Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald.〕叶性状的变异范围为8.40%～46.07%[19]。三叶崖爬藤块茎表型性状中，除单株块茎数量外，块茎直径和单株块茎鲜质量的变异系数较大，分别为51.95%和48.59%，远大于天麻(GastrodiaelataBl.)[20]单株块茎生物量的变异系数(19.91%)和半夏〔Pinelliaternata(Thunb.) Breit.〕[21]块茎直径的变异系数(19.91%)；三叶崖爬藤块茎中总黄酮含量的变异系数为38.23%，高于杜仲(EucommiaulmoidesOliver)[22]根部总黄酮含量的变异系数(19.35%)和苎麻〔Boehmerianivea(Linn.) Gaudich.〕[23]根中总黄酮平均含量的变异系数(9.33%)；三叶崖爬藤块茎中多糖含量的变异系数为17.03%，与天麻[24]块茎中多糖含量的变异系数(18.25%)相当。说明不同种源三叶崖爬藤的表型性状存在丰富的变异，可为种源的收集、分类和良种选育提供理论依据。

朱波等[12]比较了21个同质园栽培的三叶崖爬藤种源的农艺性状，认为广西、江西、湖南、湖北、福建和重庆等种源三叶崖爬藤的叶片较大，茎粗，新稍生长快，块茎性状优良，农艺性状总体较优，浙江种源三叶崖爬藤的茎较纤细，叶片较小，新稍长势较弱，块茎较小。这与本研究结果较相似，说明三叶崖爬藤的表型变异可通过遗传同化过程固定。而已有的三叶崖爬藤有效成分方面的研究结果[14-15]与本研究结果存在异同，推测不仅与选择的材料有关，也与聚类选择的指标有关。采用多个指标的指纹图谱对有效成分进行分析能更准确地判定药材品质的优劣，但指纹图谱没有完整的图谱查询系统，鉴定药材质量耗时耗力。杨华等[25]运用生长性状、环境适应性和经济性状共3大性状9个指标对来自浙江和江西的4个种源进行分析，认为总黄酮、多糖及移栽难易度是影响目标选择的主要因子。说明在生产中，采用总黄酮和多糖含量对三叶崖爬藤进行质量评价是可行的。

自然环境的时空异质性产生了不同的选择压力，如果选择压力大于遗传漂变和基因流作用，处于不同环境的种源则可能在形态、生理、物候及次生代谢产物等方面产生分化，出现局部适应现象[26]。三叶崖爬藤分布广泛的现状必然导致其自然种群经历不同的选择压力而进化。基于ISSR分子标记的研究证实，不同种源三叶崖爬藤间具有较高的遗传分化[27]。采用TCS软件构建的单倍型谱系关系也证实，上新世早期的全球变冷和地质变化引发的地理隔离事件导致三叶崖爬藤祖先种源压缩到中国西南部和南部这2个避难所，进而形成2个独立的地理谱系[28]。同质园实验结果表明：三叶崖爬藤在适应长期选择压力的情况下，其表型性状已经产生一定分化。

利用植物性状间的相关性可提高育种效率[29]。大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中异黄酮含量与株高和节数呈负相关，与单株荚数、单株粒数、单株粒质量和百粒质量呈正相关，大豆苷含量与单株荚数呈负相关[30]；枳椇子〔Hoveniatrichocarpavar.robusta(Nakai et Y. Kimura) Y. L. Chou et P. K. Chou〕中二氢杨梅素含量与千粒质量及红黑籽粒比例呈极显著正相关[31]；树皮不裂、小叶数为7或9枚且小果径的青钱柳〔Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.〕多糖含量较高[32]。三叶崖爬藤块茎品质与某些表型性状存在显著或极显著的相关性，但是否可以将其作为筛选块茎中总黄酮和多糖含量较高种源的初步参考性状还需要进一步研究。