DNA条形码技术在渔业资源研究中的应用展望

李乐康，张颂，王先勇，方磊

摘要：从DNA条形码技术的研究现状、筛选要求、鉴定优势等方面进行了介绍，并归纳总结了DNA条形码技术在渔业资源研究中的优势、应用方向，以及可能遇到的问题，以期对渔业资源研究中的DNA条形码应用提供参考。

关键词：DNA 条形码;渔业资源;物种鉴定

中图分类号：R282.5  S932    文献标识码：A

DNA条形码技术是一种物种鉴定新技术，2003年，由加拿大生物分类学家Paul Hebert等受到条形码技术的启发，首次正式提出DNA条形码的概念[1]，即利用DNA的线性核苷酸排列建立类似的条形码，得到了生物学界的普遍认可并迅速发展。2004年生物条形码联盟成立，2007年加拿大Guelph大学组建了第一个DNA barcoding鉴定中心，2009年“国际生命条形码计划”正式启动。DNA条形码技术是指通过基因组内一段足够变异的、较短的标准DNA片段来建立DNA标记与物种信息之间的一一对应关系，从而建立一种生物信息识别系统，实现对物种的快速、准确鉴定[2-3]。

渔业资源又称水产资源，是指水域中具有开发利用价值的鱼、甲壳类、贝、藻和海兽类等经济动植物的总体。渔业资源的储备量和生物多样性是渔业可持续发展的基础。一直以来我国都是渔业大国，2016年全社会渔业经济总值达到了23662.29亿元。但随着社会发展和环境变化，一些种群退化、甚至遭到灭绝，维持最大程度的生物多样性被认为具有更大的迫切性。因此，正确的认识和区分物种十分重要，DNA条形码技术作为分类学中新兴的方便、快捷、准确的鉴定手段，实现对物种的快速识别。

1  DNA条形码技术的研究现状

目前，动物、植物、微生物物种的DNA条形码都得到了各方学者的普遍关注和广泛研究，其中动物DNA条形码研究进行的最早。2003年Hebert等比较了11门13320个拥有相近亲缘关系的同属物种COI序列，发现种间差异约11.3%，而种内差异仅约为1%。另外通过研究线粒体基因色素细胞C氧化酶亚单位I（COI）的结构、突变特点、携带的进化信息及引物通用性设计等方面的特点，综合考虑，提出使用该基因片段（约650bp）作为动物的DNA条形码[4]。目前该基因片段所为DNA条形码已经在鱼类[5-6]、鸟类[7-9]、节肢动物[10]、软体动物[11]、哺乳类[12]、两栖类[13]等动物的研究上获得了成功，对动物物种的分辨率达到了95%[14]，COI已被国际生命条形码联盟确定为动物物种鉴定的标准条形码[15]。植物的线粒体遗传分化小、进化速度慢，因此COI基因片段并不适合植物条形码的研究[16-17]。2009年墨西哥召开的第三届国际DNA条形码会议上，国际生命条形码联盟植物工作组初步确定了叶绿体基因片段rbcL和matK联合使用作为植物DNA条形码的标准片段[18]。微生物DNA条形码的研究工作主要集中在真菌类群，ITS已经广泛应用与真菌的分类鉴定中，对真菌物种的分辨率达到72%[19-21]。

2  DNA条形码的筛选要求

理想的DNA条形码应满足的标准为[22-23]：

2.1  合适的进化速率

在生物进化的过程中，DNA进化的速率不同，候选条形码的序列需要具备合适的进化速率，种间差异大，种内差异小，存在条形码间隙;

2.2  足够的遗传信息

候选条形码的DNA序列需具备足够多的遗传信息，便于区分不同等级的生物物种;

2.3  实现标准化

对不同物种、不同类群实现DNA标准化操作，使用同一位点;

2.4  序列保守

候选序列两端具有高度保守性，便于设计物种间的通用引物，易于扩增，且序列长度应便于扩增，且能够完成破损样本的DNA分析。

3  DNA条形码的鉴定优势

地球上生物种类丰富，达到一百五十多万种[24]，传统的分类学鉴定是依照形态学及解剖学特征，并按照林奈双名法命名分类。然而，能够分类鉴定的物种仅占15%[25]，人类的识别能力有限，传统的分类学专家也越来越少，分类学科发展滞后。相比于传统的分类学鉴定，DNA条形码具有明显的优势[23、26-29]，具体包括：

⑴操作简单、方便、快捷，借助标准化操作和数据库，可以实现大规模样本的鉴定，并且对操作人员的专业技能并没有过高的要求，非专业人员经过培训也可操作;

⑵准确性高，被确定为DNA条形码的序列具有特异性且非常稳定，会避免传统分类学出现的因性别、分类阶段或環境条件造成的表型变化和工作人员的主观经验引起鉴定错误，可以发现新种;

⑶样本要求低，样本个体非常小或非常大不易猎杀以及降解的样本均能进行鉴定，例如真菌、胃里面的食物碎片、排泄物和腐蚀样本;

⑷信息共享方便，有专门的数据库，信息进行不断的补充和更新，数据库不断完善。

4  DNA条形码在渔业资源研究中的应用方向

4.1  渔业资源生物多样性的保护和系统发育进化研究

我国渔业资源种类丰富，按水域分为内陆水域渔业资源和海洋渔业资源，生物多样性位居世界前列，如今，随着人类活动的过多干预，一些水生生物种群退化，还有很多种类遭受到了严重的威胁，比如江豚，更有的物种如白鱀豚走向灭绝。如何科学有效的保护生物多样性已经成为保护渔业资源最重要的任务，DNA条形码技术除了快速、高效的鉴定物种外，更能准确的计算出多样性指数，预测生物多样性格局，促进生物多样性的研究[30-31]。之前的研究表明，群落结构定位是否准确由系统发育关系正确与否决定，DNA条形码通过对基因序列的分析及数据处理，构建生物系统发育关系图谱，完善人类对生物进化关系的认识，可以弥补传统分类和研究的不足。Zemlak等利用DNA条形码技术，成功重建了印度洋近海和远海的35种代表鱼类系统分类关系[32]，Wong等利用DNA条形码技术更好的研究了鲨鱼种内变异情况[33]。

4.2  珍稀水生野生動物的科学保护和有效监管

我国有很多珍稀水生动物资源，在我国重点保护野生动物名录中，列入世界自然保护联盟IUCN濒危、极危级别的就约有35种，保护珍贵、濒危水生野生动植物及其栖息地对维护生态平衡，维持生态资源可持续发展至关重要。此外，我国大量的珍稀物种包括水生生物被国外研究人员或商业机构通过多种途径带出国门，对我国的生物资源造成了极大损失[34]，非法交易也是目前国际上难以有效避免的难题，传统的技术手段很难对珍稀的生物资源进行有效鉴定，DNA条形码技术不但可以快速鉴别物种，还不受物种形态的影响，局部组织或经过处理的样本也能有效区分，从而提升海关等政府部门对生物资源有效监管和保护的能力。DNA条形码建立的大规模数据库也为如何科学保护水生野生动物提供有利参考。Armstrong等对10年内新西兰边境截获的石蝇标本COI序列进行分析发现，鉴定结果与传统手段的结果高度一致，但却大大缩短了鉴定时间[35]。

4.3进行有害水生生物和入侵水生生物的研究

社会发展的不断进步加速了国球一体化进程，国内、国际贸易往来和旅游业的快速发展也增加了外来物种入侵和有害生物传播的几率，检验检疫机构是我国生态安全的重要屏障，然而样品数量的激增和通过形态特征鉴定的效率低下已经不能满足相关业务的需要，遇到形态特征模糊不清的样本，如残片、粪便、卵等，更加难以用传统的手段进行鉴别，DNA条形码进行有害生物和入侵物种鉴定具有相当显著的优势，可以辅助传统手段对检验检疫工作严格把关，维护我国生态安全不受侵害。

5  展望

DNA条形码技术研究还有很多制约因素，完整的数据化平台建立需要采集大量的样本，整合大数据进行DNA条形码资源的共享，现在的研究水平，数据库生物多样性信息还不完善，DNA条形码技术的应用还具有局限性。此外，地理隔离对物种的影响让鉴定结果存在不确定性，Sperling研究了大量昆虫的COI序列发现，至少四分之一的物种不容易根据序列来区分[36]，因此，作为DNA条形码的基因需要进一步研究。DNA条形码技术建立以来，取得了丰硕的研究成果，虽然这一技术还存在质疑，但是其对分类学研究的推动和应用意义毋庸置疑，前景十分光明，其与传统分类学相结合，必定会成为生物学研究的一种重要工具。在渔业资源的研究中，DNA条形码技术也会发挥其优势，推动我国渔业资源的研究与保护，推动水产科研事业的更好发展。

参考文献

[1]Hebert PDN， Cywinska A， Ball SL， et al. Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc Lond B， 2003， 270 （1512）： 313-21

[2]Hebert PDN， Gregory TR The promise of DNA barcoding for taxonomy.Systematic Biology， 2005， 54：852–859

[3]Ren BQ， Chen ZD.DNA barcoding plant life. Chinese Bulletin of Botany ，2010， 45：1-12

[4]Hebert PDN， Ratnasingham S， Dewaard JR. Barcoding animal life： cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci， 2003， 270 （Suppl 1）： 96-9

[5]Savolainen V，Cowan R.S，Vogler A.P，et al.Towards writing the encyclopedia of life： An introduction to DNA barcoding， Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci， 2005，360（1462）：1805-1811

[6]Ward R.D， Zemlak T.S， Innes B.H， et al. DNA barcoding Australia's fish species， Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci， 2005，360（1462）：1847-1857

[7]Hebert PDN， Stoeckle MY， Zemlak TS，et al.Identification of birds through DNA barcodes， PLoS Biol， 2004，2（10）： e312

[8]Tavares ES， and Baker AJ， Single mitochondrial gene barcodes reliably identify sister-species in diverse clades of birds， BMC Evol. Biol， 2008，8（1）：81-81

[9]Lijtmaer DA， Kerr KCR， Barreira AS，et al. DNA barcode libraries provide insight into continental patterns of avian diversification. PLoS ONE，2011， 6：e20744.

[10]Hajibabaei M， Janzen DH， Burns JM， et al. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006，103：968-971

[11]Puillandre N， Strong EE， Bouchet P， et al.  Identifying gastropod spawn from DNA barcodes： possible but not yet practicable. Molecular Ecology Resources，2009，9：1311-1321

[12]Murphy RW， Crawford AJ， Bauer AM，et al. Cold Code： the global initiative to DNA barcode amphibians and nonavian reptiles. Molecular Ecology Resources， 2013，13：161–167.

[13]Che J， Chen HM， Yang JX，et al.Universal COI primers for DNA barcoding amphibians. Molecular Ecology Resources， 2012，12：247–258.

[14]张宇，郭良栋.真菌DNA条形码研究进展，菌物学报，2012，31（6）：809-820

[15]裴男才，陈步峰.生物DNA条形码：十年发展历程、研究尺度和功能，生物多样性，2013，21（5）：616-627

[16]Chase MW， Salamin N， Wilkinson M，et al.Land plants and DNA barcodes： short-term and long-term goals. Philosophical Transactions of the Royal Society B： Biological Sciences，2005， 360：1889–1895.

[17]Kress WJ， Wurdack KJ， Zimmer EA， et al.Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2005，102：8369–8374.

[18]CBOL Plant Working Group A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences ，2009，106： 12794–12797.

[19]Horton TR， Bruns TD .The molecular revolution in ectomycorrhizal ecology： peeking into the black-box. Molecular Ecology， 2001，10：1855–1871.

[20]Wang Q， Guo LD. Ectomycorrhizal community composition of Pinus tabulaeformis assessed by ITS-RFLP and ITS sequences. Botany， 2010，88：590–595.

[21]Hollingsworth PM， Forrest LL， Spouge JL， et al. A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009，106：12794-12797

[22]Taberlet P， Coissac E， Pompanon F， et al.Power and limitations of the chloroplast trnL （UAA） intron for plant DNA barcoding. Nucleic Acids Research， 2007，35：e14

[23]程熙婷，王愛民，顾志峰，等.DNA条形码研究进展，基因组学与应用生物学，2011，30（6）：748-758

[24]Hawksworth DL. Challenges in mycology， Mycol. 1995，99：127-128

[25]Gregory TR.DNA barcoding does not compete with taxonomy， Nature，2005， 434（7037）： 1067

[26]Tautz D， Arctander P， Minelli A，et al. A plea for DNA taxonomy， Trends Ecol. 2003，18（2）：70-74

[27]Witt JDS， Therloff DL， and Hebert PDN， DNA barcoding reveals extraordinary cryptic diversity in an amphipod genus： Implications or desert spring conservation， Mol.Ecol，2006，15（10）：3073-3082

[28]Janzen DH.Integration of DNA barcoding into an ongoing inventory of complex tropical biodiversity.Molecular Ecology Resources，2009， 9（1）：1-26

[29] Gibbs J.Integrative taxonomy identifies new （andold） species inThe Lasioglossum （Dialictus） tegulare （Robertson） species group （Hymenoptera， Halictidae）.Zootaxa， 2009， 2032：1-38

[30]Feng G， Zhang JL，Pei NC， et al.Comparison of phylobetadiversity indices based on community data from Gutianshan forest plot. Chinese Science Bulletin， 2012，57：623–630

[31]Pei NC， Zhang JL，Mi XC， et al.Plant DNA barcodes promote the development of phylogenetic community ecology. Biodiversity Science ，2011， 19：284–294.

[32]Zemlak TS，Ward RD，Connell AD， et al.DNA barcoding reveal soverlooked marine fishes.Molecular Ecology Resources， 2009， 9 （s1）：237-242.

[33]Wong EHK， Shivji MS， Hanner RH.Identifying sharks with DNA barcodes：assessing the utility of a nucleotide diagnostic approach. Molecular Ecology Resources， 2009， 9（s1）：243-256.

[34]陳士林，庞晓慧，罗焜，等.生物资源的DNA条形码技术.生命科学，2013，25（5）：458-466

[35] Armstrong KF， Ball SL. DNA barcodes for biosecurity： invasive species identifi cation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2005， 360（1462）：1813-23

[36]Sperling F.DNA Barcode：deusexmachine.Newsletter of the Biological Survey of Canada（Terrestrial Arthrop）.Opinion Page，2003， 22（1）：50-53