植烟土壤高活性氨化菌的筛选鉴定及其氨化能力分析

王小花　黄莺　陈雪　夏梓林　代飞　刘昌　张恒

摘  要：为调控植烟土壤有机态氮分解，从贵州省威宁县和湄潭县植烟土壤分离出52株氨化细菌。通过纳氏试剂法和氨化菌培养液培养法筛选，发现W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9、Z50对有机氮具有较强的分解效果。16S rDNA序列分析表明，菌株W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9和Z50分别属于金黄杆菌属、泛菌属、芽孢杆菌属、简单芽孢杆菌属、梭形杆菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、巨大芽孢杆菌属、短波单胞菌属和节杆菌属。通过氨化菌培养液培养法对菌株的分解能力测定表明，培养72 h后，Z9菌株的有机氮分解能力显著（≤0.05）高于其余9株，分解效果达到46.1%～93.4%。室内有机肥培养试验结果显示，施用菌株处理的无机氮含量均高于不施用菌株处理（CK），培养65 d时各菌株处理较CK处理无机氮含量增加了550.80～1823.71 mg/kg，添施菌株使无机氮含量提高了1.15～1.49倍。研究结果可用于有机氮分解复合微生物菌剂的配置。

关键词：植烟土壤;有机态氮;氨化细菌;筛选;分解能力

中图分类号：S572.01          文章编号：1007-5119（2019）03-0031-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.005

Abstract： To regulate the decomposition of organic nitrogen in tobacco soil， 52 strains of ammoniated bacteria were isolated from the soil of Weining and Meitan. After screening by the Nessler's reagent method and the ammoniated culture medium culture method， bacterial strains W2， W4， W6， W12， W16， Z3， Z6， Z15， Z9 and Z50 with strong decomposition effects on organic nitrogen were identified. 16S rDNA sequence analysis indicated that strains W2， W4， W6， W12， W16， Z3， Z6， Z15， Z9 and Z50 belong to ， ， sq.， ， ， sq.， ， ， B and . The results from the ammoniated culture medium culture method showed that the organic nitrogen decomposition ability of Z9 was significantly higher （≤0.05） than that of the other 9 strains after 72 h of culture， with the decomposition effect of 46.1%-93.4%. The results of indoor organic fertilizer culture test showed that the inorganic nitrogen content of the treatment with bacterial strains was higher than that of the treatment without bacteria （CK）， the inorganic nitrogen content of the treatment with bacterial strains increased 550.80-1823.71 mg/kg after 65 days of cultivation， and the inorganic nitrogen content increased 1.15-1.49 times by adding bacterial strains. The results of this study can be applied to the configuration of organic nitrogen decomposition composite microbial agents.

Keywords： tobacco planting soil; organic nitrogen; ammoniated bacteria; screening; decomposition ability

氮素是對烤烟产量、品质影响最关键的营养元素，在烤烟获得优质高产的过程中发挥着重要的作用。目前在烤烟生产中，因过于追求高产而大量施用氮肥，导致烤烟贪青晚熟、烟叶内在品质不协调及氮素大量损失并引发环境问题。而烤烟生长获取的氮素主要以无机氮形式为主，无法大量吸收大分子的有机态氮，而有机态氮转化成无机态氮的速度较慢，不能很好地满足烤烟生长前期对无机氮的需求。因此，如何在降低氮肥使用量的同时，增强土壤有机氮的分解率，提高植烟土壤中铵态氮含量，以满足烤烟对无机氮“少时富，老来贫”的需求特性，成为目前烤烟施肥中亟待解决的关键问题。

氨化细菌是能分解有机氮化物而产生氨的一类微生物，是氨化作用的主要驱动力，而氨化作用是土壤氮素分解环节的起始环节，直接关系到后续氮素分解过程。为了满足烤烟生长前期对无机态氮的需求，可以分离筛选分解土壤有机氮效果较强的微生物菌剂，来调控土壤中无机氮的释放。但近年来，许多学者的研究主要集中于烟田施入复合微生物菌肥后对烤烟的生产效应、复合微生物菌剂对堆肥过程中的影响及水体脱氮，结合当地生态条件筛选出适应环境的不同功能菌株报道较少。本研究从两个植烟土壤中分离纯化筛选出适合当地生境的高活性氨化细菌，采用分子生物学方法对分离出的菌株进行鉴定，同时研究其对有机氮的分解效果，为应用有机氮分解复合菌剂提高烤烟品质提供优良的菌种资源。

1  材料与方法

1.1  供试土壤及类型

贵州省湄潭县抄乐乡，黄壤;贵州省威宁县黑石镇，黄棕壤。其土壤理化性状见表1。

1.2  采样方法

2017年7—8月共采集土壤样品60个，其中湄潭抄乐30个，威宁黑石30个。于烤烟旺长期采集新鲜土样，装于灭过菌的牛皮纸袋中并置于冰桶内带回实验室。土样过2 mm筛，−4 ℃冰箱中保存，供分离氨化细菌用。

1.3  培养基的制备

蛋白胨琼脂培养基用于氨化细菌的分离提纯，牛肉膏蛋白胨液体培养基用于氨化菌的氨化作用强度测定，LB液体培养基用于活化菌种及富集培养。

1.4  氨化细菌的分离提纯

称取10.00 g土样加入90 mL放有玻璃珠的无菌水中，置于30 ℃摇床上振荡30 min，充分打散菌体胶团。得到的土壤悬浮液采用梯度稀释法进行氨化细菌的分离，根据菌落数量、形态、颜色、表面状况及染色特征，选取具有代表性的单个菌落用无菌接种环挑出，并按照无菌操作要求在相应的固体培养基上采用划线法进行培养和纯化。

1.5  高活性氨化细菌筛选

纯化出的菌株采用纳氏法进行初步检测，若出现深黄色或黄色沉淀证明培养液中有氨化细菌将蛋白质分解后产生NH，由此现象初步确定所分离的菌株为氨化细菌。从中挑选出菌液为深黄色和黄色的菌株作为高活性菌株的待选株。采用滴定法测定其活性大小，进行复筛。

1.6  菌株16S rDNA鉴定

按照细菌DNA试剂盒（BIOMIGA）说明书提取出PCR反应DNA模板，于−20 ℃条件下保存备用。然后采用27 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）和1492 R（5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'）通用引物对16s rDNA进行PCR扩增。进行PCR扩增后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段回收后送上海英潍捷基贸易有限公司进行DNA片段测序，测序结果在GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行BLAST比对分析，进行种属鉴定。

1.7  高活性氨化菌株對有机氮分解能力测定

将分离鉴定后的各氨化细菌分别接种于LB液体培养基中活化，于恒温摇床（130 r/min，28 ℃）

中培养12 h。然后将活化好的各氨化细菌菌液按1%的量接种于100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，每株菌设3次重复。于恒温摇床（130 r/min，28 ℃） 中进行培养，培养时间分别为0、12、24、36、48和72 h，定时取样，测定各菌株培养液的铵态氮浓度。铵态氮浓度测定采用滴定法，试验用水均为无氨水。

1.8  高活性氨化菌株对有机肥氮转化能力测定

将筛选出的高活性菌种分别接种至100 mL培养液中进行12 h活化培养。然后将活化好的各菌液按1%的量加入有机肥原料中，充分混合均匀后，喷洒蒸馏水，使有机肥水分保持在田间持水量的60%。置于25 ℃恒温培养箱内培养，分别于0、5、35和65 d取样，测定铵态氮（靛酚蓝比色法）和硝态氮含量（紫外分光光度法）。每盆有机肥原料质量为500 g，每菌种重复3次，以不添加菌种的有机肥为对照CK（表2）。

1.9  数据处理

采用Excel 2016进行试验数据整理，利用DPS V7.05统计软件对实验数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

2  结  果

2.1  高活性氨化细菌菌株的筛选

2.1.1  菌株的分离初筛  从威宁和湄潭植烟土壤中分别分离出27株、25株具有氨化作用的菌株，滴加纳氏试剂后菌株均呈现出不同程度的黄色，各种菌株的测试结果见表3。颜色越深菌株的活性越强，因此，选择了深黄色、黄色的氨化菌株，即菌株W16、W4、W2、W12、W6、W22、W25、W17、W21、W5、Z9、Z50、Z6、Z15、Z3、Z19、Z48、Z10、Z8、Z13和Z11，并对它们进行复筛。

2.1.2  菌株的复筛  由表4可知，湄潭土壤各氨化细菌菌液中的NH-N浓度大小为Z9>Z15>Z50> Z6>Z3>Z19>Z48>Z10>Z8>Z13>Z11，威宁土壤各氨化细菌菌液中的NH-N浓度大小为W2>W16>W4> W6>W12>W22>W25>W17>21>W5。其中，除了湄潭土壤菌株Z15、Z50、Z9和Z10之间呈现显著性差异和威宁土壤菌株W2、W6和W12之间呈现显著性差异外，其他菌株则没有存在差异。因此，各植烟土壤分别选取Z9、Z15、Z50、Z6、Z3、W2、W16、W4、W6和W12作为优势菌株。

2.1.3  菌株16S rDNA鉴定  将筛选出的高活性氨化菌株Z9、Z15、Z50、Z6、Z3、W2、W16、W4、W6和W12做进一步的16S rDNA分子系统学鉴定。以氨化细菌总基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增（图1），约在1500 bp处PCR特征扩增条带明亮、无拖带，其分子量大小与菌株16S rDNA的理论值相符，表明所提取的氨化细菌总基因组DNA质量好、纯度高，可进行下一步测序分析。

测序后将菌株的16S rDNA序列在NCBI进行BLAST比对分析。经鉴定后发现，各菌株的同源性都达到99%～100%（表5）。一般认为，全序列相似性在99%～100%的细菌，定为同一个种，相似性97%～99%的细菌定为同一个属。结果表明菌株W2是金黄杆菌属（），W4属于泛菌属（），W16为梭形杆菌属（），Z6為土壤杆菌属（），Z9和Z50分别属于短波单胞菌属（）和节杆菌属（P，其余W6、W12、Z3、Z15均为芽孢杆菌属（），集中在简单芽孢杆菌属（）和巨大芽孢杆菌属（）两个细菌类群。

2.2  高活性氨化菌株对有机氮分解效果

从图2可知，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中，所筛选菌株均可以将有机氮转化成NH-N，且随着培养时间的延长，NH-N浓度不断增高，说明细菌培养液中有机氮不断被转化为NH-N。各菌株在24 h前铵态氮浓度都缓慢增加，表明菌株处于适应期。培养24 h后菌株W2、Z9和Z15铵态氮浓度明显快速增加，说明菌株在24 h后进入对数生长期。而菌株Z50铵态氮浓度在培养36 h后趋于稳定，菌株W12和W16在培养48 h后就趋于稳定，表明菌株Z50比W12和W16进入成熟期的时间早，菌量增加幅度变小、活性减弱。培养72 h后菌株W2、W16、W4、W6、W12、Z9、Z15、Z50、Z3和Z6处理中铵态氮浓度分别336、291.2、284.5、259.8、226、458.1、429、241.4、208.9和208.9 mg/L，有机氮分解率分别达到68.5%、59.4%、58.1%、53%、46.1%、93.4%、87.6%、49.3%、42.6%和42.6%，菌株Z9和Z15分解能力与其余菌株差异显著。表明菌株Z9和Z15氨化活性活力最高。

2.3  高活性氨化菌株处理下有机肥中氮形态转化

有机肥培养过程中各处理铵态氮含量均呈下降趋势（图3），而各处理硝态氮含量均呈上升趋势（图4）。添加菌株处理的有机肥无机态氮含量随培养时间的延长呈上升趋势（图5），且增加量均高于未施菌肥处理。培养65 d时，与对照（CK）相比，各菌株处理无机氮含量增加了550.80～1823.71 mg/kg，添施菌株使无机氮含量提高了1.15～1.49倍，其中效果较为显著的处理分别为W6、W16、W2和Z3。菌株W6、W4、Z3和Z50处理的无机氮含量培养

35 d比培养5 d低，表明在微生物的作用下，无机氮含量由硝态氮转化为气态N、NO及氨挥发的形式损失，导致在培养35 d时无机氮含量降低。各处理无机氮含量在培养65 d时明显增加，且添加氨化菌株有机肥的无机氮含量均高于CK，说明此时期有机肥中的氨化菌株已经完全适应了环境，对有机态氮分解加快。但是筛选时活性最大的菌株W2、Z9和Z15对有机肥中有机氮分解的效果不是最强，表明有机肥中原有的部分微生物与后来添加的微生物之间相互抑制。

3  讨  论

研究者通常采用间接测定培养液中铵态氮浓度来说明氨化菌的氨化能力。本研究利用培养液接种后，菌株W2、Z9和Z15对有机氮分解效果最显著，较初始有机氮含量分别降低了68.5%、93.4%和87.6%。李辉等研究了人工湿地中氨化细菌去除有机氮的效果，从中筛选获得的氨化细菌-1、氨化细菌-2与氨化细菌-5对有机氮的降解率分别达到46.2%、49.4%和52.6%。张文艺等从BAF反应器中分离出氨化菌T1和Z1，两株菌株对有机氮的

转化率分别为86.91%和69.98%，相比之下本研究筛选的菌株有机氮分解率较高。但由于试验环境条件和测定方法的差异，需在相同环境下采用同样方法进一步比较。

有机肥的微生物有效性低，无机态氮素释放速率慢，难以满足烤烟生长前期需要。而有机氮的分解转化，主要由氨化菌、亚硝化菌、反硝化菌、固氮菌起作用，其中氨化菌对有机氮的分解起决定作用。研究表明添施微生物菌剂后，随着氨化细菌数量的增加，会增强氨化作用的强度，从而促进有机氮的分解。微生物菌剂还显著影响土壤细菌的群落结构，促进土壤中有益菌的增殖，促使土壤细菌组成得到改善。本研究添加的菌剂定殖能力很强，在有机肥中发挥了自身的氨化能力，提高了有机肥中无机氮的释放速率，这有利于烤烟生长前期土壤无机态氮的增加，可解决配施有机肥后氮素分解速率慢，难以供给烤烟生长需要的问题。有机氮转化为铵态氮的过程中，由于存在硝化细菌，促使有机肥中铵态氮大量转化为硝态氮，因此添施菌剂对有机肥中有机氮转化为铵态氮的贡献率仍需进一步的深入探讨。

芽孢杆菌种群庞大，繁殖能力强，耐热、耐酸碱、理化性质稳定，抑菌谱广泛，为目前主要的生防菌株;泛菌属（）不仅具有耐盐能力，还具有固氮的作用;土壤杆菌属（）除了具有固氮、土壤重金属修复等作用，也应用于海洋方面;短波单胞菌属（）、节杆菌属（）、梭形杆菌属（）等均对有机物及重金属具有降解作用。故本试验中所筛选获得的菌株均为有益细菌，不会引起烟株及土壤病虫害。

4  结  论

从貴州省威宁县和湄潭县植烟土壤中筛选获得活性较强的氨化菌株W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9和Z50，通过16S rDNA鉴定及BLAST同源性分析，确定菌株W2、W4、W6、W12、W16、Z3、Z6、Z15、Z9和Z50分别属于金黄杆菌属（）、泛菌属（）、芽孢杆菌属（）、简单芽孢杆菌属（）、梭形杆菌属（）、芽孢杆菌属（）、土壤杆菌属（）、巨大芽孢杆菌属（）、短波单胞菌属（）和节杆菌属（）。这10株菌株均具有较强的氨化能力，可促进有机肥中有机氮的分解，加速无机氮素的释放，对于烤烟生产具有良好的应用价值。筛选出的菌株可进一步为氮转化复合微生物菌剂的配置提供优质的菌种资源，但有待通过生产应用进一步鉴定其实际使用效果。

参考文献

[1]     COLLIES W K， HAWKS S N J R. Principles of flue-cured tobacco production[M]. Raleigh N C： North Carolina State University， 1994.

[2]     张焕菊，陈刚，王树声，等. 应用生物有机肥减少烤烟化肥用量试验研究[J]. 中国烟草科学，2015，36（1）：48-53.

ZHANG H J， CHEN G， WANG S S， et al. Reducing the chemical fertilizer rate with bio-organic fertilizer applied on tobacco production[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36（1）： 48-53.

[3]     夏昊. 黔西南州烤烟氮素调控技术研究[D]. 贵阳：贵州大学，2017.

XIA H. Studies on regulated technology of nitrogen for flue-cured tobacco in Qianxinan， Guizhou Province， China[D]. Guiyang： Guizhou University， 2017.

[4]     王艳杰，邹国元，付桦，等. 土壤氮素矿化研究进展[J]. 中国农学通报，2005，21（10）：203-203.

WANG Y J， ZOU G Y， FU H， et al. Development and advance of soil nitrogen mineralization[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2005， 21（10）： 203-203.

[5]     刘秀. 有机氮分解菌的驯化筛选及其特性研究[D]. 合肥：合肥工业大学，2012.

LIU X. Isolation and characterization of organic nitrogen decomposing bacteria[D]. Hefei： Hefei University of Technology， 2012.

[6]     余佳斌，张晓强，文锦涛，等. 微生物菌剂对修文烟区植烟土壤理化性状及烤烟产质量的影响[J]. 浙江农业科学，2018，59（3）：382-387.

YU J B， ZHANG X Q， WEN J T， et al. Effects of microbial agents on physical and chemical properties of tobacco-growing soil and yield and quality of flue-cured tobacco in Xiuwen tobacco growing area[J]. Journal of Zhejiang Agricultural Science， 2018， 59（3）： 382-387.

[7]     丁梦娇. 植烟黄壤中氮代谢优势细菌的筛选及复合菌

剂应用效果研究[D]. 贵阳：贵州大学，2016.

DING M J. The advantage of nitrogen metabolic bacteria screening and compound bacterium agent application effect in the plant tobacco yellow soil[D]. Guiyang： Guizhou University， 2016.

[8]     高云航，勾长龙，王雨琼，等. 低温复合菌剂对牛粪堆肥发酵影响的研究[J]. 环境科学学报，2014，34（12）：3166-3170.

GAO Y H， GOU C L， WANG Y Q， et al. Effects of the cold-adapted complex microbial agents on cattle manure composting[J]. Journal of Environmental Science， 2014， 34（12）： 3166-3170.

[9]     欧阳建新，施周，崔凯龙，等. 微生物复合菌剂对污泥好氧堆肥过程的影响[J]. 中国环境科学，2011，31（2）：253-258.

OUYANG J X， SHI Z， CUI K L， et al. Application of compounded microbial inoculants on composting process of excess activated sludge[J]. China Environmental Science， 2011， 31（2）： 253-258.

[10]   张琴，张陇利，魏晓明，等. 复合菌剂接种鸡粪堆肥的效应研究[J]. 农业环境科学学报，2007，26（5）：1963-1967.

ZHANG Q， ZHANG L L， WEI X M， et al. Effects of microbe consortium inoculation on chicken manure composting[J]. Journal of Agricultural Environmental Sciences， 2007， 26（5）： 1963-1967.

[11]   赵婷婷，范培成，姚立荣，等. 氨化细菌对植物浮岛人工湿地中有机氮强化分解[J]. 农业工程学报，2011，27（S1）：223-226.

ZHAO T T， FAN P C， YAO L R， et al. Ammonifying bacteria in plant floating island of constructed wetland for strengthening decomposition of organic nitrogen[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 2011， 27（S1）： 223-226.

[12]   王娟，戴習林，宋增福，等. 一株氨化细菌的分离、鉴定及氨氮降解能力的初步分析[J]. 水生生物学报，2010，34（6）：1198-1201.

WANG J， DAI X L， SONG Z F， et al. Isolation and identification of ammonifying bacterium and characteristics of degrading NH-N[J]. Acta Hydrobiologica Sinica， 2010， 34（6）： 1198-1201.

[13]   姚槐应，黄昌勇，等. 土壤微生物生态学及其实验技术[M]. 北京：科学出版社，2006：160-164.

YAO H Y， HUANG C Y， et al. Soil microbial ecology and its experimental techniques[M]. Beijing： Science Press， 2006： 160-164.

[14]   李振高，骆永明，滕应. 土壤与环境微生物研究法[M]. 北京：科学出版社，2008：364-368.

LI Z G， LUO Y M， TENG Y. Methods of soil and environmental microbiology[M]. Beijing： Science Press， 2008： 364-368.

[15]   J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]. 北京：科学出版社，2005.

SAMBROOK J， RUSSELL D W. Molecular cloning experimental guide[M]. Beijing： Science Press， 2005.

[16]   全国农业技术推广服务中心. 土壤分析技术规范[M]. 北京：中国农业出版社，2006.

National Agricultural Technology Extension Service Center. Soil analysis technical specification[M]. Beijing： China Agriculture Press， 2006.

[17]   JANDA J M， ABBOTT S L. Bacterial identification for publication： when is enough？[J]. J Clin Microbiol， 2002， 40： 1887-1891.

[18]   李辉，徐新阳，李培军，等. 人工湿地中氨化细菌去除有机氮的效果[J]. 环境工程学报，2008，2（8）：1044-1047.

LI H， XU X Y， LI P J， et al. Research on ammon bacteria removal organic nitrogen in construction wetland[J]. Journal of Environmental Engineering， 2008， 2（8）： 1044-1047

[19]   张文艺，李秋艳，赵婷婷，等. BAF反应器中氨化细菌的筛选与氨化特性分析[J]. 环境工程学报，2011，5（12）：2890-2894.

ZHANG W Y， LI Q Y， ZHAO T T， et al. Isolation of amonifying bacteria from BAF reactor and analysis on amination characterization[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering， 2011， 5（12）： 2890-2894.

[20]   丁美丽. 烟地土壤微生物特性与氮素生物有效性的关系[D]. 贵阳：贵州大学，2006.

DING M L. Relation between the soil microbial characteristics and biological availability of Nitrogen for tobacco， L. K326[D]. Guiyang： Guizhou University， 2006.

[21]   赵晓雨. 菌剂对牛粪堆肥及其氮素转化微生物的影响[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2015.

ZHAO X Y. Effects of Inoculant on cow manure compost and its nitrogen transformation microbes[D]. Harbin： Northeast Agricultural University， 2015.

[22]   施河麗，孙立广，谭军，等. 生物有机肥对烟草青枯病的防效及对土壤细菌群落的影响[J]. 中国烟草科学，2018，39（2）：54-62.

SHI H L， SUN L G， TAN J， et al. Control efficiency of bio-organic fertilizers on tobacco bacterial wilt and their effects on soil bacterial community[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（2）： 54-62.

[23]   徐同偉，周建云，祖庆学，等. 两株烟草黑胫病拮抗菌的筛选、鉴定和促生防病潜力评价[J]. 中国烟草科学，2017，38（3）：44-50.

XU T W， ZHOU J Y， ZU Q X， et al. Screening， identification biocontrol and growth-promoting potential evaluation of two bacterial strains against tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（3）： 44-50.

[24]   黄智华，崔永和，计思贵，等. 云南烤烟根际土壤PGPR菌株的筛选与鉴定[J]. 中国烟草科学，2017，38（5）：18-23.

HUANG Z H， CUI Y H， JI S G， et al. Isolation and identification of PGPR strain in rhizosphere soil of Yunnan flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（5）： 18-23

[25]   张之矾，王开宇，孟源，等. 五种生防芽孢杆菌碳源代谢表型分析[J]. 中国烟草科学，2018，39（4）：64-70.

ZHANG Z Z， WANG K Y， MENG Y， et al. Phenotypic characterization of carbon source metabolism in five biocontrol Bacillus species[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（4）： 64-70.

[26]   史国英，李杨瑞，林丽，等. 一株甘蔗内生固氮泛菌属细菌及其应用：CN 102732443 A[P]. 2012.

SHI G Y， LI Y R， LIN L， et al. A strain of Endophytic Nitrogen-fixing Panbacteria from sugarcane and its application： CN 102732443 A[P]. 2012.

[27]   傅蕾，李霞，高璐，等. 盐胁迫下泛菌属内生细菌对杂交狼尾草发芽及生理的影响[J]. 草业科学，2017，34（10）：2099-2108.

FU L， LI X， GAO L， et al. Endophytic bacteria can mitigate salinity stress on seed germination and physiology in hybrid pennisetum[J]. Grass Science， 2017， 34（10）： 2099-2108.

[28]   黄耀坚，黄益丽，刘三震，等. 具有免疫活性多糖海洋细菌菌株的筛选[J]. 应用海洋学学报，2004，23（1）：38-42.

HUANG Y J， HUANG Y L， LIU S Z， et al. Screening of marine bacterial strains with immunoactive polysaccharides[J]. Journal of Applied Oceanography， 2004， 23（1）： 38-42.

[29]   杨金凤. 生物通风修复柴油污染土壤实验及柴油降解菌的降解性能研究[D]. 北京：中国地质大学，2009.

YANG J F. Experimental study of diesel contaminated soil remediation by bioventing and degradation characters of diesel-degrading bacteria[D]. Beijing： China University of Geosciences， 2009.

[30]   李娟，CONSTANTINE UWAREMWE，冷艳，等. 节杆菌属细菌处理有机物和重金属污染物的研究进展[J]. 环境科学与技术，2017（10）：89-97.

LI J， CONSTANTINE UWAREMWE， LENG Y， et al. Progress on the study of biodegradation of organic pollutants and adsorption of heavy metals with Arthrobacter strains[J]. Environmental Science and Technology， 2017（10）： 89-97.

[31]   吴石金. 二氯甲烷降解菌的分离鉴定、降解特性及关键酶基因克隆与表达研究[D]. 杭州：浙江工业大学，2009.

WU S J. Isolation and identification of dichloromethane- degrading bacteria， characteristics of biodegradation， cloning and expression of key enzyme genes[D]. Hangzhou： Zhejiang University of Technology， 2009.