尿酸对乳鼠心肌成纤维细胞胶原合成及炎性分泌影响

王妍琦 肖帅 孙海鹏 王春鹏 王其新

[摘要]目的探讨尿酸对原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞（CFs）胶原合成及炎性分泌的影响，以及micro-RNA-155（miR-155）在其中的作用。方法分离培养乳鼠CFs，并用不同浓度（0、200、400、600、800 μmol/L）的尿酸处理。采用MTT法检测CFs的增殖情况，羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测炎性因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平。将miR-155 inhibitor转染入CFs，选择前述实验结果较为稳定的600 μmol/L尿酸刺激CFs 24 h，采用荧光定量PCR检测miR-155、IL-6、IL-1β、TNF-α、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）的表达水平。结果与0 μmol/L尿酸组相比较，400、600、800 μmol/L尿酸组CFs的增殖和胶原含量增加（F=18.46、11.82，P<0.05），200、400、600、800 μmol/L尿酸组CFs IL-6、IL-1β、TNF-α的表达增加（F=29.32～69.76，P<0.05）。miR-155 inhibitor可明显抑制尿酸诱导的IL-6、IL-1β、TNF-α、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达增加（F=72.74～275.32，P<0.05）。结论尿酸可以通过miR-155促进CFs的胶原合成及炎性分泌。

[关键词]尿酸;心肌;成纤维细胞;微RNAs;胶原;炎症

[中图分类号]R542.33[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2019）03-0290-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effects of uric acid on collagen synthesis and inflammatory secretion in primary cultured neonatal rat cardiac fibroblasts （CFs） and the role of microRNA-155 （miR-155） in the process. MethodsThe CFs of neonatal rats were isolated and treated with different concentrations of uric acid （0， 200，400，600， and 800 μmol/L）. The proliferation of CFs was evaluated by MTT assay， the collagen content was determined by hydroxyproline assay kit， and the expression of inflammatory factors interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The CFs were then transfected with miR-155 inhibitor and stimulated with 600 μmol/L uric acid， which yielded stable results in the above test， for 24 h. The expression of miR-155， IL-6， IL-1β， TNF-α， collagen type Ⅰ （Col-Ⅰ）， and collagen type Ⅲ （Col-Ⅲ） was determined by quantitative real-time PCR. ResultsCompared with the group treated with 0 μmol/L uric acid， the groups treated with 400， 600， and 800 μmol/L uric acid had significantly increased proliferation and collagen content of CFs （F=18.46 and 11.82，P<0.05）， and the groups treated with 200， 400， 600， and 800 μmol/L uric acid had significantly increased expression of IL-6， IL-1β， and TNF-α in CFs （F=29.32-69.76，P<0.05）. However， the increased expression of IL-6， IL-1β， TNF-α， Col-Ⅰ， and Col-Ⅲ induced by uric acid was significantly inhibited by miR-155 inhibitor （F=72.74-275.32，P<0.05）. ConclusionUric acid acts through miR-155 to promote collagen synthesis and inflammatory secretion of CFs.

[KEY WORDS]uric acid; myocardium; fibroblasts; microRNAs; collagen; inflammation

心力衰竭（簡称心衰）是众多心血管疾病的最终归宿，心脏重塑和炎症是心衰发展过程中的关键病理标志。心肌纤维化是心脏重塑的关键原因，也是多种心脏疾病发展至一定阶段的常见病理改变[1]。心肌成纤维细胞（CFs）是心脏中数量最多的细胞，其主要功能是调节细胞外基质（ECM）平衡。当心脏受损时（缺血、低氧、物理化学刺激等），CFs增殖活化，分泌炎性细胞因子，合成胶原增多，这是心肌纤维化的主要病理途径[2]。大量流行病学研究表明，高尿酸血症是多种心血管疾病的独立危险因素[3-7]，血尿酸水平升高可以增加病人心衰及不良预后的风险，且与心室重构有着密切关系[8-9]。近年来，尿酸对心血管疾病影响的基础研究主要集中在心肌细胞的损伤上[10-11]，而关于尿酸对心肌纤维化和CFs影响的研究报道相对较少。MicroRNA-155（miR-155）已被证明可以在多种心血管疾病中发挥作用[12-15]。最近的研究表明，miR-155能够增加心肌重构过程中蛋白的过度沉积[12，16]，但是miR-155在CFs炎症反应中的作用研究相对较少。本研究应用尿酸刺激CFs，观察其对细胞炎性分泌及胶原合成的影响，并探讨miR-155在其中的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物出生2～3 d的Wistar大鼠，雌雄不限，购自青岛大任富城畜牧有限公司。

1.1.2试剂尿酸（Sigma公司），DMEM培养液、2.5 g/L胰酶（含0.2 g/L EDTA）和胎牛血清（Hyclone公司），MTT试剂盒（Solarbio公司），羟脯氨酸试剂盒（南京建成科技有限公司），Lipofectamin 2000（Invitrogen公司），大鼠白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（欣博盛公司），miR-155 inhibitor及其阴性对照、miRNA PCR试剂盒（广州锐博生物科技有限公司），总RNA试剂盒（美国Omega公司），逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒（天根生物公司），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2CFs的分离培养

取10～15只出生 2～3 d的Wistar大鼠，无菌条件下取出心脏，放入预冷D-Hanks液中洗净淤血，剪取心室，将组织剪成大小约1 mm3的碎块，加入0.8 g/L胰蛋白酶2 mL，置于 37 ℃水浴中消化10 min，吹打1 min，吸除上清，再加入0.8 g/L胰蛋白酶2 mL消化2～3 min，吸取上清至5 mL胎牛血清中终止消化，如此反复10～15次至组织完全消化。用 200 目筛网过滤细胞悬液，收集滤液至离心管中以l 500 r/min离心10 min，将所得细胞用含体积分数0.10胎牛血清的 DMEM 培养液重懸，充分吹打后将细胞转入培养瓶中，置于37 ℃含体积分数0.05 CO2的培养箱中差速贴壁培养1 h，弃未贴壁细胞，加入含体积分数0.10胎牛血清的 DMEM 培养液继续培养，取2～4代细胞进行后续实验。

1.3MTT法检测CFs增殖情况

取培养状态良好的CFs，接种于96孔板，每孔100 μL（5 000个细胞），培养24 h，分别用不同浓度（0、200、400、600、800 μmol/L）的尿酸处理24 h，加入MTT溶液每孔10 μL，孵育4 h，弃上清，再加入DMSO每孔100 μL，置摇床上低速震荡10 min，用酶标仪检测490 nm波长处吸光度（A）值。每组设4个复孔。

1.4羟脯氨酸法检测CFs胶原含量

取培养状态良好的CFs，接种于6孔板培养24 h，分别给予不同浓度的尿酸（0、200、400、600、800 μmol/L）处理24 h，取细胞培养液，按照试剂盒说明书操作，用羟脯氨酸法检测胶原蛋白含量。

1.5ELISA 法检测CFs炎性因子表达

取培养状态良好的CFs，接种于6孔板培养24 h，分别给予不同浓度的尿酸（0、200、400、600、800 μmol/L）处理24 h，用ELISA 法检测细胞培养上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平。

1.6细胞转染

取培养状态良好的CFs，接种于6孔板培养24 h。按照说明书分别将miR-155 inhibitor及其阴性对照与Lipofectamin 2000温和混匀，室温孵育20 min，后将混合液加入到各孔中，置于培养箱中培养 6 h。选择前述实验结果较为稳定的600 μmol/L尿酸进行刺激。实验设尿酸组、尿酸+阴性对照组以及尿酸+inhibitor组。采用荧光定量PCR方法检测各组CFs中miR-155的表达情况。

1.7荧光定量PCR检测炎性因子及胶原mRNA的表达

实验设正常对照组（A组）、尿酸组（B组）和尿酸+inhibitor组（C组）。采用荧光定量PCR方法检测各组CFs中IL-6、IL-1β、TNF-α、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ） mRNA表达水平。

1.8统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，所得数据均符合正态分布以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1乳鼠CFs的形态

倒置显微镜下观察，培养3～5 d时CFs呈融合状态，细胞大且薄，呈长梭形或多角形，略透明，排列紧密，交叉重叠生长，无自发搏动。

2.2不同浓度尿酸对CFs增殖的影响

尿酸作用24 h后，400、600、800 μmol/L尿酸组MTT法所测的A值较0 μmol/L尿酸组明显增加（F=18.46，P<0.05），而200 μmol/L尿酸组与0 μmol/L尿酸组相比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

2.3不同浓度尿酸对CFs胶原含量的影响

尿酸作用24 h后，400、600、800 μmol/L尿酸组CFs胶原蛋白含量较0 μmol/L尿酸组明显增加（F=11.82，P<0.05），而200 μmol/L尿酸组与0 μmol/L尿酸组相比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

2.4不同浓度尿酸对CFs炎性因子表达的影响

不同浓度尿酸作用24 h后，与0 μmol/L尿酸组相比，200、400、600、800 μmol/L尿酸组CFs炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达均显著增加（F=29.32～69.76，P<0.05）。见表2。

2.5转染CFs后各组miR-155的表达

以600 μmol/L尿酸处理细胞24 h后，尿酸组CFs miR-155的相对表达量为1.00±0.00，尿酸+阴性对照组为1.07±0.10，尿酸+inhibitor组为0.31±0.08，尿酸+inhibitor组miR-155的相对表达量明显低于尿酸组及尿酸+阴性对照组（F=172.65，P<0.05）。

2.6MiR-155对尿酸诱导的CFs中炎性因子及胶原mRNA表达的影响

荧光定量PCR检测显示，miR-155 inhibitor可以明显抑制600 μmol/L尿酸诱导的IL-6、IL-1β、TNF-α、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达增加（F=72.74～275.32，P<0.05）。见表3。

3讨论

高尿酸血症是一种常见的代谢性疾病，与高血压、血脂异常、糖代谢受损等密切相关[5]，是心血管疾病的一个重要的独立危险因素[4-7]。有临床研究显示，在普通人群中，血尿酸水平与左心室肥厚存在独立相关性[17];在老年心衰病人中，血尿酸水平与心室重构明显相关且独立于肾功能之外[7，18]。动物实验研究显示，血尿酸水平升高可以诱导小鼠心室重塑、炎症、心肌纤维化以及胶原相关酶的分泌异常[19-21]。在细胞水平，尿酸可以诱导CFs增殖、内皮素-1（ET-1）表达增加和活性氧（ROS）生成增多等氧化应激反应[22]，但是尿酸对CFs胶原合成及炎性因子分泌的影响尚未见报道。

心肌纤维化是心脏受损后，炎症介导心肌细胞坏死、凋亡，ECM异常增多和过度沉积的病理过程。心脏ECM主要由胶原、蛋白多糖、糖蛋白、生长因子和蛋白酶等构成，其中的胶原主要是Col-Ⅰ和表1不同浓度尿酸对CFs增殖和胶原合成的影响（n=3，A，±s）尿酸浓度（c/μmol·L-1）细胞增殖胶原蛋白Col-Ⅲ[23]。生理状态时，CFs通过合成胶原、分泌胶原水解酶，合成新胶原蛋白替代老化的胶原蛋白，从而稳定心脏ECM的成分和结构[24]。心脏损伤后，受到自分泌和旁分泌的调控，CFs活化并迅速增殖，向损伤区域迁移，分泌ECM（主要是胶原），从而促进伤口愈合和瘢痕形成[25-26]，当心脏持续接受外界刺激时，则会造成胶原的过度沉积，形成心肌纤维化[27]。本实验结果显示，CFs的增殖能力以及合成Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的量在一定范围内随尿酸浓度的增加而增加，表明较高浓度的尿酸可以诱导CFs过度合成胶原，导致心肌纤维化的发生。

心脏炎症可以触发CFs的表型转化，增加心肌胶原沉积，是心脏重构的一个病理关键[28]。心脏损伤后，CFs可以产生促炎性细胞因子、趋化因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等），募集炎性细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等）到心脏组织中，CFs与炎性细胞相互作用，引发心脏炎症的恶性循环[29-30]。高尿酸血症病人血清炎症指标升高，说明高尿酸血症可引起机体炎症反应[31]。最近有研究结果表明，CFs中NLRP3炎症小体的激活在心脏炎症反应中起关键作用[32-33]。而尿酸可以通过激活NLRP3炎症小体，释放促炎性细胞因子到细胞外，介导炎症反应[34]。因此，我们推测尿酸可以诱导CFs的炎症反应。本实验结果显示，一定浓度尿酸可刺激CFs分泌炎性细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α），可见尿酸可以在一定程度上促进心脏炎症的发生发展。

研究已证明，某些microRNAs在某些特定的疾病中过度表达，它们通过单独或者联合作用调节疾病的发生发展。miR-155在各种炎症性心脏病，包括心肌肥大、心肌炎、动脉粥样硬化和心衰中起重要作用[35]。最近研究发现，miR-155参与心脏重塑的病理过程，miR-155敲除可以改善血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心脏重塑，减轻胶原沉积，而miR-155的过度表达则可促进CFs的表达转化[12]。本研究通过抑制miR-155表达来探讨miR-155在尿酸诱导的心肌纤维化中的作用，结果表明miR-155在尿酸诱导的心肌纤维化中起促进作用，它参与了CFs的胶原合成及炎性分泌。

综上所述，尿酸可以通过miR-155促进CFs的胶原合成及炎性分泌，抑制miR-155则可减轻上述反应，提示靶向miR-155可能作为心肌纤维化的潜在治疗方法。

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（本文編辑 马伟平）